天然蛋白純化
2019年6月15日
沒(méi)有評(píng)論
一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)。
一個(gè)典型的真核細(xì)胞可以包含數(shù)以千計(jì)的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)。
枯草芽孢桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)，擁有適用于分泌表達(dá)及胞內(nèi)表達(dá)的菌株以及對(duì)應(yīng)的多種表達(dá)載體，可以滿足不同表達(dá)需求。孢桿菌分泌的真核來(lái)源的重組蛋白具有天然構(gòu)象和生物活性，避免形成包涵體；表達(dá)周期短，蛋白產(chǎn)率高。
重組蛋白純化主要方法有三種：親和層析：在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的， 親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)分離純化方法。利用不同的層析柱，采用親和層析的原理
細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動(dòng)態(tài)變化對(duì)各種生命過(guò)程有重要影響。例如在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，常常伴隨著某些蛋白質(zhì)的表達(dá)異常。
蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)蛋白的研究往往是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，從蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾及蛋白間互做的方面進(jìn)行分析，也稱為蛋白組學(xué)分析。
基因的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，反應(yīng)了生命活動(dòng)正在發(fā)生的事情。蛋白質(zhì)組成及含量變化的研究愈演愈烈。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，一方面，WB、ELISA這些依賴于抗體的檢測(cè)方法，對(duì)抗體質(zhì)量要求極高。另一方面，基因水平的表達(dá)與蛋白含量的變化相關(guān)性較差。
病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing , VIGS）是研究基因功能的一種有效工具。它已被用于進(jìn)行正向和反向遺傳學(xué)研究，以確定植物基因參與哪種代謝或通路。然而，這項(xiàng)技術(shù)尚未充分發(fā)揮其潛力。
原位雜交（in situ hybridization）將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，來(lái)檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。
大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清晰，培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，生長(zhǎng)繁殖快，成本低廉，可快速大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白的優(yōu)點(diǎn)，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過(guò)細(xì)菌中蛋白量的30%，因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。
信號(hào)通路，又加信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（signal transduction pathway）：在細(xì)胞中，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互識(shí)別、相互作用，將信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)換和傳遞，構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)外界環(huán)境變化時(shí)，單細(xì)胞生物可以直接做出反應(yīng)，多細(xì)胞生物則通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳遞系統(tǒng)來(lái)傳遞信息，從而調(diào)控機(jī)體活動(dòng)。
探討細(xì)胞信號(hào)通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，關(guān)鍵基因研究?？梢允褂棉D(zhuǎn)錄組、DGE、WB、qPCR、ELISA等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
一些微生物被廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵，生產(chǎn)乙醇、食品及各種酶制劑等。對(duì)工業(yè)微生物開(kāi)展的基因組研究，不斷發(fā)現(xiàn)新的特殊酶基因及重要代謝過(guò)程和代謝產(chǎn)物生成相關(guān)的功能基因，可以將其應(yīng)用于生產(chǎn)以及傳統(tǒng)工業(yè)、工藝的改造，同時(shí)推動(dòng)現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展。
雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation， BiFC)分析技術(shù)，是由Hu等在2002年最先報(bào)道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法， 是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。
蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究蛋白間相互作用的一種有效技術(shù)手段。轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
酵母單雜交體系自1993年由Wang和Reed創(chuàng)立以來(lái)，在生物學(xué)研究領(lǐng)域中已經(jīng)顯示出巨大的威力。應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)驗(yàn)證了許多已知的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了新的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，并由此找到了多種新的轉(zhuǎn)錄因子。
定點(diǎn)突變（Site-directed mutagenesis）是通過(guò)PCR等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（包括堿基的添加，缺失，以及堿基的替換）來(lái)改造基因。
轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）是二聚的轉(zhuǎn)錄因子/核酸酶，由33至35個(gè)氨基酸模塊構(gòu)成，其中每個(gè)靶定單個(gè)核苷酸。通過(guò)組裝這些模塊，研究人員可靶定他們想要的任何序列，是靶向基因編輯的常用工具之一。
Southern 印跡雜交（Southern blot）是進(jìn)行DNA 特定序列定位的通用方法。1975 年由英國(guó)人Southern 創(chuàng)建，是研究DNA 圖譜的基本技術(shù)。
小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）有時(shí)稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個(gè)長(zhǎng)20到25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。