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染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）

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技術待認領

圖片來源：www.biogo.net

ChIP概述

染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是于生物體內(nèi)研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的方法。其原理是在活細胞或組織的狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合體，再將染色質(zhì)DNA隨機打斷成小片段, 通過目的蛋白的特異性抗體富集與目的蛋白結合的DNA片段。通過PCR或qPCR技術檢測富集產(chǎn)物中的特定DNA片段的含量可以定性分析目標蛋白與特定DNA片段是否結合；或通過對富集產(chǎn)物進行測序分析，篩選可能與目的蛋白結合的DNA片段。

（鐘鼎生物編輯；轉(zhuǎn)導生物完善）

ChIP技術詳情

ChIP技術流程

簡而言之，染色質(zhì)免疫沉淀技術的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，超聲波將染色質(zhì)打碎后，用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復合體。只有與目的蛋白結合的DNA片段才能夠被沉淀下來。如下圖

染色質(zhì)免疫沉淀技術示意圖【王春雨，?石建黨，?朱彥，?et al。?染色質(zhì)免疫沉淀技術在研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應用[J]。?遺傳，?2005，?27(5):801-807?！?/p>

1、細胞的甲醛固定

甲醛是一種高分辨率的可逆的交聯(lián)劑，能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)。其原理為#在甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的α氨基及賴氨酸-精氨酸-組氨酸-色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起，在幾分鐘內(nèi)形成生物復合體，防止細胞內(nèi)組分的重新分布；而且，甲醛并不作用于游離的雙鏈DNA，從而避免DNA的損傷。特別是，甲醛交聯(lián)反應是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中分別對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%，而交聯(lián)時間需要預實驗來確定。這是因為#交聯(lián)時間過長，則實驗材料易丟失，且交聯(lián)后的DNA-蛋白質(zhì)復合體難以用超聲打斷；交聯(lián)時間過短，則交聯(lián)不完全。通常的交聯(lián)時間為5min-1h，可以隨時加入甘氨酸來終止交聯(lián)反應。

2、超聲波斷裂染色質(zhì)

甲醛交聯(lián)后的染色質(zhì)對限制酶和 DNaseI高度抵抗，因此通常使用機械剪切力使得染色質(zhì)斷裂。打斷后的染色質(zhì)片段的平均長度應該在500~1000bp左右（可以用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定）。染色質(zhì)片段的平均長度對于蛋白質(zhì)在DNA上結合位點的高分辨率作圖非常重要。

3、染色質(zhì)免疫沉淀和免疫沉淀復合體的純化

用目的蛋白特異性的抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀?？贵w的量要進行優(yōu)化，防止非特異的結合。用Protein-A/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀復合體。經(jīng)過洗滌除去非特異結合的染色質(zhì)后，用1%SDS+NAHCO3洗脫免疫沉淀復合體。

4、交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

在免疫沉淀復合體中加入不含DNase的RNase和Proteinase K（也可以不加蛋白酶K，交聯(lián)逆轉(zhuǎn)后用QIAquick DNA cheanup system回收DNA，蛋白還可用于做進一步的分析）65℃保溫6h使交聯(lián)逆轉(zhuǎn)。經(jīng)酚氯仿抽提-乙醇沉淀純化DNA。純化的DNA極少，可用色譜定量。

5、染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結合位點的鑒定

染色質(zhì)免疫沉淀的DNA的分析方法有許多種。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是目的蛋白的靶序列，可以采用熒光定量PCR分析；如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因組上的分布情況，找出反式作用因子的結合位點，可以采用DNA芯片、高通量測序等方法。

（王春雨撰寫，聚生物完善）

ChIP-seq與ChIP-chip技術特點對比

ChIP-seq和ChIP-chip都是高通量研究蛋白質(zhì)DNA相互作用的方法，但ChIP-seq具有許多ChIP-chip技術無法媲美的優(yōu)勢

ChIP-seq最大的優(yōu)勢就是可以精確到單個核苷酸的分辨率。盡管可以通過增加微陣列上排布的探針數(shù)目來提高ChIP-chip的分辨率，但是對于大型基因組而言，這就意味著需要增加大量的探針和費用。除此之外，探針雜交過程中的不確定性也限制了 ChP-chip的分辨率。

ChIP-seq減少了ChIP-chjp探針雜交過程中產(chǎn)生的噪音。?核酸雜交過程是一個相對復雜的過程，受諸多因素影響，如靶序列和探針序列的 GC含量、長度、拷貝數(shù)、二級結構等，因此，不完全匹配的序列間相互雜交事件經(jīng)常發(fā)生，不可避免地引入大量噪音。?

由于芯片信號識別過程中弱信號常常會被丟棄而強信號會飽和，因此通過ChIP-chip獲得的信號強度往往不是線性的，其信號強度的量程限定在一定范圍內(nèi)，而ChIP-seq有效地避免了這種情況。Alekseyenko等在相同的實驗條件下比較了ChIP-seq和ChIP-chip數(shù)據(jù)識別能力，發(fā)現(xiàn)ChIP-seq中出現(xiàn)的一些明顯的且具有生物學意義的峰（Peaks）常常在ChIP-chip中被掩蓋。

ChIP-seq的顯著優(yōu)勢就是基因組覆蓋范圍不受固定在微陣列上探針的限制。這對分析基因組上的重復區(qū)域（如微衛(wèi)星序列）尤其重要，ChIP-seq可以通過分析重復序列的側(cè)翼序列將這些重復序列精確定位到基因組，而這些信息往往在微陣列方法中被掩蓋。在覆蓋范圍方面，ChIP-seq可以覆蓋整個基因組而ChIP-chip通常是選擇性地掃描一些特定區(qū)域，因此可以在一個更廣闊的視野總覽基因組全貌。比如，為了考察某個轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結合情況，傳統(tǒng)的ChP-chip通常是選取已知基因的GpC島或轉(zhuǎn)錄起始位點（transcriptional?start?site，TSS）)附近的片段作為考察對象，這種方法通?？梢垣@取大部分的轉(zhuǎn)錄因子結合位點。然而最近人們發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子（如?p53、cMYC等）其結合位點在基因組上的分布遠非我們之前認為的那樣局限而是廣泛分布于整個基因組。對于這類轉(zhuǎn)錄因子，ChIP-chip往往是不合適的。

隨著測序技術的發(fā)展，每一次測序運行(run)容納的 reads數(shù)目越來越多，通過在標本準備階段對不同的樣本進行不同的接頭（adaptor）標記處理，可以實現(xiàn)在一次運行中同時檢測多個樣本，如此大大提高ChIP-seq的性價比。

在測序所需樣本數(shù)量方面，ChIP-chip需要多達 4~5ug的起始樣本，通常在雜交之前需要進行連接介導聚合酶鏈反應（Ligation-mediated?polymerase chain reaction，LM-PCR）)，可能導致背景增高或競爭性擴增導致假陽性。而ChIP-seq僅需要 ng級起始材料，可以只需要很少的擴增循環(huán)或完全不需要擴增，并且隨著單分子測序平臺以及第三代測序技術的出現(xiàn)，測序所需的DNA總量更是大大減少，這對于那些難以大量培養(yǎng)的細胞如神經(jīng)細胞和干細胞，或難以區(qū)分個別細胞與總體細胞行為的實驗是很有裨益的。

（梁芳撰寫）

ChIP一定需要甲醛固定嗎？

染色質(zhì)免疫沉淀是該技術的基礎，根據(jù)在ChIP過程中是否需要對蛋白質(zhì)DNA進行交聯(lián)處理，ChIP可分為X-ChIP和N-ChIP兩類，其中X表示“交聯(lián)”，N表示”自然狀態(tài)”。X-ChIP主要適用于結合力較弱的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究：首先，通過福爾馬林處理處于生長狀態(tài)下的活細胞，使DNA結合蛋白與DNA緊密交聯(lián)；然后，采用超聲儀超聲處理染色質(zhì)，將染色質(zhì)隨機打斷為 200~1000 bp的小片段；接著，采用目的蛋白特異性的抗體免疫沉淀蛋白質(zhì) DNA復合體，富集目的蛋白靶定的DNA片段;最后，解交聯(lián)蛋白質(zhì) DNA復合體，獲取純凈的 DNA片段。

而N-ChIP主要用于組蛋白修飾、核小體定位的研究。由于組蛋白與?DNA之間的作用力較強，因此在N-ChIP實驗中不需要采用福爾馬林處理活細胞，而是讓?DNA結合蛋白與DNA之間保持一種自然狀態(tài)，然后，采用一種微球菌核酸酶（MNase）對染色質(zhì)進行消化。在染色質(zhì)免疫沉淀過程中，抗體的質(zhì)量和對照實驗的設計是至關重要的。選擇特異且有效的抗體一方面能夠盡可能全面地捕獲相關信息，一方面減少了其他噪音的干擾，從而保障了后續(xù)實驗的進行;而合理的對照試驗設計則進一步保證了結果的客觀性與真實性。?

（梁芳撰寫）

ChIP實驗中基因組DNA超聲破碎條件

通常來說，超聲的細胞濃度在1 ×10⁷/mL左右，超聲體積視具體儀器而定，對于寧波新芝 TZ-ID型細胞粉碎儀，適合的超聲體積為 330-400μL，過大體積將使超聲能量無法均勻有效地達到每一處，產(chǎn)生超聲不均勻現(xiàn)象，部分片段過大，部分過小;探頭深度以距離1.5mL Eppendorf管底部為3-5mm為宜，超聲功率起始設在85%，超聲參數(shù)的設置影響并不是很大。本研究嘗試過3s開，6s間歇；1s開，3s間隙；5s開，9.9s間歇，試驗結果并無很大差異(數(shù)據(jù)未展示)。超聲過程中由于高能量的作用而使溶液變熱，高溫可使蛋白變性而影響后續(xù)的免疫沉淀反應，間歇時間讓處于冰水浴中的管子冷卻，只要不引起溶液溫度過高，間歇的時間長短并無太大影響。

（李敏俐撰寫）

常用試劑盒

名稱	品牌	貨號	規(guī)格
QuikChIP ChIP Kit	Novus	NBP2-29902	1 Kit
Chromata ChIP ChIP Kit	Novus	NBP1-71709	30 Immunoprecipitations
Chromata ChIP Histone H3 [ac Lys9, ac Lys14] ChIP Kit	Novus	NBP1-71714	25 Immunoprecipitations
ChIP-IT? Express	Active Motif	53008	25 rxns
Pierce? Agarose ChIP Kit	Thermo Scientific	26156	30 reactions
Pierce? Magnetic ChIP Kit	Thermo Scientific	26157	30 reactions
ChIP Kit	Abcam	ab500	1 kit
High-Sensitivity ChIP Kit	Abcam	ab185913	24 tests

（聚生物編輯）

參考文獻

1.王春雨，石建黨，朱彥， et al。染色質(zhì)免疫沉淀技術在研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用中的應用[J]。遺傳， 2005， 27(5):801-807。
2.梁芳，徐柯，龔朝建，等。染色質(zhì)免疫沉淀-測序:全基因組范圍研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的新技術[J]。生物化學與生物物理進展， 2013， 40(3):216-227。
3.李敏俐，關善輝，陸祖宏。染色質(zhì)免疫沉淀試驗中基因組DNA超聲破碎條件優(yōu)化策略[J]。生物技術通報， 2010(05):121-125。

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