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甲醛輔助分離調(diào)控元件（FAIRE）技術(shù)

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專家：朱馨蕾

圖片來(lái)源：http://csbj.org/articles/e2017025.pdf

FAIRE 技術(shù)指導(dǎo)專家

朱馨蕾博士是FAIRE技術(shù)領(lǐng)域權(quán)威專家，在利用FAIRE技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄因子功能及表觀遺傳學(xué)方面有深入見(jiàn)解，對(duì)如何提高轉(zhuǎn)錄因子固定效率、提高結(jié)果信噪比、解釋數(shù)據(jù)等方面有豐富經(jīng)驗(yàn)，利用該技術(shù)先后在在魚(yú)類(lèi)發(fā)育及寄生蟲(chóng)學(xué)研究方向發(fā)表7篇高水平論文，聚生物特邀朱馨蕾博士指導(dǎo)FAIRE聚透技術(shù)板塊的內(nèi)容編輯。

FAIRE概述

甲醛輔助分離調(diào)控元件 (Formaldchyde?Assisted?IsoJation?of?Regulatory?Elements, FAIRE) 是近年來(lái)才建立的新技術(shù),最初應(yīng)用于酵母細(xì)胞,后被用于多種細(xì)胞,可以和DNase-Seq技術(shù)相結(jié)合,揭示開(kāi)放型染色質(zhì)的特征,是研究DNA?水平調(diào)控的優(yōu)選方法.分子生物學(xué)研究表明,在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中,用來(lái)合成RNA的DNA模板會(huì)發(fā)生規(guī)律性變化,從而調(diào)控基因表達(dá)和生物體的發(fā)育DNA?水平的基因表達(dá)調(diào)控最重要的途徑就是通過(guò)“開(kāi)放”型活性染色質(zhì)(activechromation)結(jié)構(gòu).真核生物的活躍轉(zhuǎn)錄是在常染色質(zhì)上進(jìn)行的.轉(zhuǎn)錄發(fā)生之前,染色質(zhì)常常會(huì)在特定區(qū)域被解螺旋,變?yōu)樗沙跔顟B(tài)59,形成自由DNA。生物體通過(guò)核小體結(jié)構(gòu)的解體或改變,DNA本身局部結(jié)構(gòu)的變化,從右旋型變?yōu)樽笮?Z-DNA)等,使得結(jié)構(gòu)基因暴露,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子DNA的結(jié)合,從而誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄。研究表明,使用?DNase?I處理各種組織細(xì)胞的染色質(zhì)時(shí)[2,40,發(fā)現(xiàn)處于活躍狀態(tài)的基因比非活躍狀態(tài)的?DNA?更容易被DNase?I所降解。雞成紅細(xì)胞染色質(zhì)中,B-血紅蛋白基因比卵清蛋白基因更容易被DNase?I切割降解。與此相反,雞輸卵管細(xì)胞的染色質(zhì)中被DNaseI優(yōu)先降解的是卵清蛋白基因,而不是B-血紅蛋白基因,研究發(fā)現(xiàn),活躍表達(dá)基因所在染色質(zhì)上一般含有一個(gè)或者數(shù)個(gè)DNase?I超敏感位點(diǎn),它們大多位于基因5’端啟動(dòng)子區(qū)域,少數(shù)在其他位置。有人用專一切割單鏈DNA的SI核酸酶處理該基因活躍表達(dá)的染色質(zhì)DNA,證實(shí)有DNA被水解,說(shuō)明該基因活躍表達(dá)時(shí)啟動(dòng)區(qū)部分庁列可能解開(kāi)成單鏈,從而不能繼續(xù)纏繞在核小體上,使啟動(dòng)區(qū)DNA?裸露于組蛋白表面,形成了對(duì)DNase?I的超敏感現(xiàn)象。上述事實(shí)充分說(shuō)明,超敏感位點(diǎn)的存在可能是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)律性變化的結(jié)果。正是由于這種變化,使DNA容易與RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合,從而啟動(dòng)基囚表達(dá),同時(shí)也更易于被核酸酶所降解。

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FAIRE技術(shù)詳情

FAIRE 的發(fā)現(xiàn)過(guò)程

FAIRE的發(fā)現(xiàn)十分偶然,是在用ChIP-chip技術(shù)構(gòu)建酵母Set1甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組蛋白甲基化分右圖譜的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的。ChIP 實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)照DNA(INPUT DNA),制備INPUT DNA時(shí),無(wú)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行甲醛處理和染色質(zhì)的免疫沉淀,只糯將細(xì)胞全基因組DNA用酚氯仿抽提制備即可,而在制備INPUT DNA的實(shí)驗(yàn)中,研究人員因誤操作,將制備INPUT DNA的細(xì)胞進(jìn)行了甲醛交聯(lián),但在制備DNA時(shí)未進(jìn)行反交聯(lián),而直接用酚氯仿抽提法制備基因組DNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所制備的基因組DNA中,桕對(duì)于非編碼區(qū) DNA(non-coding region DNA)而官,編碼區(qū)DNA(coding region DNA)得到明顯富集。這種結(jié)果最初被解釋為該酵母細(xì)胞編碼區(qū) DNA含有大量的甲基化核小體,后來(lái)在缺少H3K4甲基化的突變體酵母紐胞系中也觀察到這種現(xiàn)象(42。對(duì)這一現(xiàn)象的進(jìn)一步研究,使得Nagy和Lieb在2003年首次報(bào)道了該實(shí)驗(yàn)方法37,該課題組主要關(guān)注染色質(zhì)組裝,尤其側(cè)重于研究核小體的動(dòng)態(tài)變化。2007年,他們將這種實(shí)驗(yàn)方法正式命名為 FAIRE[36)

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FAIRE原理

FAIRE實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括:細(xì)胞或組織培養(yǎng)、甲醛交聯(lián)、細(xì)胞裂解、超聲波打斷染色質(zhì),然后進(jìn)行酚氯仿抽提制備水相DNA、檢測(cè)水相DNA.在FAIRE酚氯仿抽提過(guò)程中,蛋白未交聯(lián)的DNA溶于水相,而蛋白結(jié)合型DNA留在兩相界面,從而把全基因組DNA分為兩部分(即水相和有機(jī)相DNA),然后對(duì)水相DNA?進(jìn)行檢測(cè),常用的檢測(cè)方法有熒光定量PCR、DNA微陣列芯片、第二代測(cè)序技術(shù)等,FAIRE樣品制備及檢測(cè)過(guò)程如下圖所示.

Figure FAIRE Procedure (A) The FAIRE procedure described in the text is shown on the left, while preparation of the reference or input sample is shown on the right. The DNA recovered from he aqueous phase of each extraction can then be used to identify sites of open chromatin using qPCR, tiling microarrays, or high-throughput sequencing applications. (B) For qPCR, a series of primers, depicted as convergent arrows, are designed to span a genomic region of interest. Sites of open chromatin are highlighted in blue, with qPCR results depicted above. Amplicons that span or are near the boundaries of open chromatin often result in lower relative enrichment due to shearing of DNA fragments, as shown by asterisks. (C) Microarrays. Typically we use highresolution microarrays that tile either regions of interest or the entire genome of an organism with 50 to 70 bp oligonucleotides. (D) High-throughput sequencing technologies can be used to map the DNA fragments back to the reference genome.【Giresi P G, Lieb J D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements)[J]. Methods, 2009, 48(3):233-239.】

近年來(lái),FAIRE?與高通量技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的?FAIRE-Seq?技術(shù),得到了廣泛應(yīng)用.將ChIP-Seq,DNase-Seq和FAIRE-Seq三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)聯(lián)用,可用于揭示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核小體分布位置、染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域,以及三者之間的關(guān)系。三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理如圖1.4所示.

Comparison of experimental protocols.Experiments to detect different aspects of DNA-binding proteins share many of the same steps; simplified schematics of the main steps are shown. a | Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP–seq) for DNA-binding proteins such as transcription factors. Recent variations on the standard protocol include using endonuclease digestion instead of sonication (ChIP–exo) to increase the resolution of binding-site detection and to eliminate contaminating DNA, and DNA amplification after ChIP for samples with limited cells. b | ChIP–seq for histone modifications uses micrococcal nuclease (MNase) digestion to fragment DNA and can also now be run on low-quantity samples when combined with the additional post-ChIP amplification. c | DNase–seq relies on digestion by the DNaseI nuclease to identify regions of nucleosome-depleted open chromatin where there are binding sites for all types of factors, but it cannot identify what specific factors are bound. d | Formaldehyde-assisted identification of regulatory elements (FAIRE–seq) similarly identifies nucleosome-depleted regions by extracting fragmented DNA that is not crosslinked to nucleosomes. LinDA, single-tube linear DNA amplification; T7, T7 phage RNA polymerase.【Furey, Terrence S . ChIP–seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein–DNA interactions[J]. Nature Reviews Genetics, 2012, 13(12):840-852.】

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FAIRE下游檢測(cè)技術(shù)

FAIRE的下游檢測(cè)技術(shù),包括熒光定量PCR,DNA芯片、第二代測(cè)序技術(shù)H2,43,45]下面簡(jiǎn)單介紹三種檢測(cè)方法的原理及步驟. 首先,應(yīng)明確覆瓦陣列(Tiling array)的含義.Tiling(tile path)指的是如瓦片一樣覆蓋基因組的探針序列,也可指熒光定量PCR 引物.相對(duì)于傳統(tǒng)微陣列技術(shù),TilingArray 的設(shè)計(jì)思路可以說(shuō)是無(wú)偏向性的。針對(duì)所選取的染色質(zhì)區(qū)域,無(wú)任何偏倚地按著一定的間隔規(guī)律、或以序列交疊的方法、或以序列頭尾相接的方式制作成探針.將相鄰探針中心位置之間的距離定義為探針的步長(zhǎng)(step或resolution). 熒光定量 PCR 可用于檢測(cè)開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn),也可以用于驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的有效性.當(dāng)設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)時(shí),需要注意以下方面:須恰當(dāng)?shù)剡x擇參考對(duì)照區(qū)域,精確的引物定位,合適的定量方法]。選擇恰當(dāng)?shù)膮⒖紖^(qū)域特別重要,因?yàn)樵谶@里我們計(jì)算的是相對(duì)于其他基因位點(diǎn)的富集程度。對(duì)于大多數(shù)生物的染色質(zhì)來(lái)說(shuō),我們并不確定應(yīng)該選擇哪些位點(diǎn)作為參考位點(diǎn),即無(wú)法確定“參考的金標(biāo)準(zhǔn)”。即使某些細(xì)胞已經(jīng)有了閉合染色質(zhì)圖譜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),但是或許這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)只適用于特定生長(zhǎng)環(huán)境條件的細(xì)胞.研究人員通常會(huì)設(shè)計(jì)相互重疊或者緊密排列的引物序列擴(kuò)增待檢測(cè)的基因區(qū)域,另外還需設(shè)計(jì)一系列陽(yáng)性和陰性引物。引物設(shè)計(jì)是獲得精確的熒光定量 PCR 結(jié)果的關(guān)鍵, 引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小一般為60~100 bp3,4使用相對(duì)Ct值法47來(lái)計(jì)算每個(gè)擴(kuò)增片段的相對(duì)富集倍數(shù)[7,43],這里的比值即是FAIRE 樣品信號(hào)與未交聯(lián)樣品信號(hào)的比值,然后全部的比值再用最小值進(jìn)行歸一化. 對(duì)于芯片實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是決定其成功與否的關(guān)鍵,也是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要應(yīng)該考慮以下方面:探針類(lèi)型、分辨率,覆蓋的基因組范圍、芯片平臺(tái)選擇等(4,對(duì)于 FAIRE 來(lái)說(shuō),最重要是高分辨率,所謂的分辨率是指一個(gè)探針到下一個(gè)探針間的基因距離,足夠密集分布的探針才能捕獲FAIRE 收集的DNA片段(200 bp左右)包含的基因組信息,那么探針之間的最小間隔是多少呢?Simon和Lieb等人的文章1451中提到最小值應(yīng)該選65 bp 或者每個(gè)FAIRE DNA片段有三個(gè)探針?lè)植?Giresi和Lieb43提到:寡核苷酸探針長(zhǎng)度為50~75 bp的Tiling array,探針之間的間隔盡可能地不超過(guò)100 bp(這就使得每個(gè)FAIRE 位點(diǎn)的探針數(shù)目減少至1~2個(gè).當(dāng)然也可以根據(jù)具體的需要恰當(dāng)?shù)剡x擇芯片所覆蓋的基因組范圍,如Eeckhoute 文章(中選取了染色質(zhì)8.11和12來(lái)設(shè)計(jì)探針. DNA芯片的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析主要包括以下四個(gè)步驟: (1)芯片制備,采用光導(dǎo)原位合成或者微量點(diǎn)樣等方法50,5),將合成的寡核苷酸有序地固定在載體表面,形成儲(chǔ)存有大量信息的高密度DNA 微陣列. (2)使用LM-PCR(連接介導(dǎo)PCR)擴(kuò)增FAIRE和 INPUT DNAL3.32, (3)用T4DNA聚合酶處理DNA片段,使DNA片段的末端成為平末端,之后用T4 DNA連接酶給DNA片段的末端連上不對(duì)稱的接頭,提供對(duì)DNA 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物結(jié)合位點(diǎn)149);最后,用與接頭DNA 互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增. (4)樣品標(biāo)記、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè),及數(shù)據(jù)分析. 大多數(shù)尋找峰(peak)的現(xiàn)存算法,都可來(lái)識(shí)別 FAIRE 富集區(qū)域,由于FAIRE和ChIP-chip實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取過(guò)程的相似性,這些算法同樣適用于ChIP-chip 數(shù)據(jù).Simon等人[45在文章中這里推薦ChIPOTle43或Mixer44。Eeckhoute 等人4使用了MAT算法來(lái)處理數(shù)據(jù).Giresi等人的文章中詳細(xì)說(shuō)明了ChIPOTle處理FAIRE 數(shù)據(jù)的過(guò)程5,首先計(jì)算四次FAIRE 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,然后輸入到ChIPOTle3,中.對(duì)于多重實(shí)驗(yàn),要經(jīng)過(guò)Benjamini-Hochberg校正,選取P值小于10的部分 peak.另外,LeelS和 Oberleyl56)等人在文章中提到多種處理陣列設(shè)計(jì)的特殊問(wèn)題及可靠的檢測(cè)方法。

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FAIRE-Seq的具體步驟

(1)按生產(chǎn)商說(shuō)明,制備測(cè)序文庫(kù)。這里我們推薦100~200?ng的?FAIRE?DNA樣品.首先使用?Agencourt?AMPure?XP?beads?試劑盒進(jìn)行兩輪純化與回收,然后進(jìn)行18個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增,篩選200-~500bp的DNA建立最終文庫(kù)。另外,也可以用TruSeq?kit(Illumina)試劑盒來(lái)制備測(cè)序文庫(kù)。關(guān)鍵步驟:保證至少3×10’讀段(reads),才可以確保測(cè)序深度和廣度
(2)運(yùn)用諸如TagDust(的算法,通過(guò)適配器過(guò)濾去除測(cè)序序列,清洗文庫(kù).我們?cè)O(shè)定錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為0.001,關(guān)鍵步驟:在清洗文庫(kù)步驟中,估計(jì)會(huì)過(guò)濾掉大概0.1~0.2%的讀段.如果過(guò)濾部分高達(dá)10%,則說(shuō)明文庫(kù)的質(zhì)量不達(dá)標(biāo).
(3)使用FASTX-Toolkit?算法(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) 來(lái)評(píng)估文庫(kù)質(zhì)量,比如說(shuō)置信值(confidence?score)),核苷酸分布(nucleotide?distribution).關(guān)鍵步驟:相對(duì)均一的堿基分布非常重要,在每個(gè)讀段中都保證有四種核苷酸。核苷酸的誤用,特殊序列的重復(fù)出現(xiàn)和序列質(zhì)量的不穩(wěn)定性,都有可能導(dǎo)致測(cè)序文庫(kù)更為復(fù)雜以及測(cè)序錯(cuò)誤增加。
(4)使用諸如Bowtie6這樣的算法,將高質(zhì)量的讀段映射(mapping)到參考基因組上。大都采取默認(rèn)參數(shù),可允許的比對(duì)數(shù)量的最大值限定為4.當(dāng)有多種比對(duì)(alignment)結(jié)果存在時(shí),Bowtie算法必定會(huì)選擇得分最高的比對(duì)結(jié)果。對(duì)于大部分的基因組和實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō),大約有75~85%的測(cè)序讀設(shè)可以被成功比對(duì).
(5)數(shù)據(jù)可視化以及尋找發(fā)觀相對(duì)于背景有明顯富集的檢測(cè)區(qū)域(使用ZINB算法(60).
(6)使用IDR算法(6?來(lái)評(píng)估交聯(lián)-折疊相關(guān)系數(shù)I45].

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參考文獻(xiàn)

1、楊振平. 基于FAIRE技術(shù)鑒定基因組中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶點(diǎn)的研究[D]. 2014.
2、Song L , Zhang Z , Grasfeder L L , et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity[J]. Genome Research, 2011, 21(10):1757-1767.
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5、Furey, Terrence S . ChIP–seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein–DNA interactions[J]. Nature Reviews Genetics, 2012, 13(12):840-852.
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