線粒體全長(zhǎng)測(cè)序
（Mitochondrial DNA Sequencing）
圖片來(lái)源：www.ebiotrade.com
技術(shù)概述
線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的一種十分重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的場(chǎng)所。線粒體擁有自身的DNA和遺傳體系，與生物進(jìn)化及細(xì)胞起源有很密切關(guān)系。線粒體基因組是分子進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育和分子標(biāo)記領(lǐng)域的重要研究對(duì)象，而獲得目的生物的線粒體基因組全序列，則成為該領(lǐng)域研究人員的首要目標(biāo)。
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物編輯）
技術(shù)詳情
除了少數(shù)低等真核生物的線粒體基因組是線狀DNA分子外，一般都是一個(gè)環(huán)狀的DNA分子。由于線粒體DNA并不容易從細(xì)胞中分離出來(lái)進(jìn)行直接測(cè)序分析，通過(guò)對(duì)總DNA進(jìn)行簡(jiǎn)并引物PCR釣取、未知序列擴(kuò)增以及長(zhǎng)PCR擴(kuò)增等方法成為了精確獲得線粒體基因組全序列最主流的方法。
微小型動(dòng)物，極易出現(xiàn)混樣，其主要難度在于提取的基因組濃度低，在實(shí)驗(yàn)方法上，采用單個(gè)個(gè)體提取基因組，核基因鑒定完后把同一目標(biāo)物種的基因組混合，然后對(duì)基因組進(jìn)行復(fù)制處理，用于短片段的調(diào)取，采用的試劑盒是：PicoPLEXTM WGA Kit。全長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)完成后再用一個(gè)個(gè)體進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證。所以對(duì)于此類物種要求樣品量充足，新鮮，盡量是一個(gè)群體采集。
植物和細(xì)菌，我們采用高通量測(cè)序測(cè)序加一代測(cè)序的方法進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，因?yàn)閱渭円蕾嚫咄考夹g(shù)難以獲取完整環(huán)形結(jié)果，需要一代測(cè)序補(bǔ)漏拼接，而且花費(fèi)的總時(shí)間較長(zhǎng)。我們采用對(duì)總DNA進(jìn)行提取，調(diào)取部分保守的基因，然后采用長(zhǎng)PCR擴(kuò)增,對(duì)這些長(zhǎng)片段進(jìn)行高通量測(cè)序。
線蟲，這類低等動(dòng)物，線粒體基因組結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上非常不平衡，某些分類階元的線蟲會(huì)表現(xiàn)出大量的基因重排和不穩(wěn)定性（基因復(fù)制，假基因）。這些基因在某些情況下，只是基因片段，在其他情況下，序列是相對(duì)保守的，但它們含有終止密碼子，似乎是沒有功能的基因[ ]。正是由于這一特點(diǎn)，我們選擇用sanger測(cè)序法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們需要不斷調(diào)整嘗試直至找到正確的基因順序，進(jìn)一步確定基因組的大小和序列，而這些是高通量所不能達(dá)到的。
原生動(dòng)物，由于這一類物種目前分來(lái)地位比較雜亂，而且有些線粒體基因組呈線狀，且數(shù)據(jù)庫(kù)中可參考的數(shù)據(jù)非常少，可想而知其測(cè)序難度。因此我們對(duì)于實(shí)驗(yàn)樣品也有很高的要求，需要量大，且純。根據(jù)我們已完成的線粒體基因組，會(huì)發(fā)現(xiàn)其擁有特殊的基因如ND9,ND7，正是由于線粒體基因組結(jié)構(gòu)特殊，而如果選用高通量測(cè)序，組裝的時(shí)候無(wú)法找到合適的參考基因組造成組裝錯(cuò)誤或無(wú)法完成組裝。
如果遇到某些物種，其線粒體基因組變異較大，并且可參考的序列較少，有時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確判斷基因間的排列順序，我們會(huì)采用基因組步移的方法來(lái)推進(jìn)?；蚴窃谄胀≒CR擴(kuò)增中，無(wú)法準(zhǔn)確獲得目的片段，也可采用基因組步移
1.5’或3’未知序列的獲取
根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)3條高退火溫度的特異性下游或上游引物，同時(shí)使用低退火溫度的簡(jiǎn)并引物,利用特異性引物與簡(jiǎn)并引物之間退火溫度的差異進(jìn)行不對(duì)稱PCR，通過(guò)三次巢式PCR獲取側(cè)翼序列。
2.對(duì)獲取的序列進(jìn)行驗(yàn)證
獲取側(cè)翼未知序列后，我們將分別在已知和未知序列上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,以驗(yàn)證獲取序列的真實(shí)性。
對(duì)于取樣，應(yīng)盡可能詳細(xì)地記錄樣品和取樣程序，并盡可能多地收集樣品。
1.如何，何時(shí)何地獲得標(biāo)本？ （地理坐標(biāo)）。
2.標(biāo)記每個(gè)樣本，如果你有條件，可以拍攝高質(zhì)量的活標(biāo)本照片，標(biāo)簽清晰可見。
3.記錄每個(gè)樣本的收集情況。 例如：他們屬于一個(gè)個(gè)體嗎？ 或者他們是從不同的群體中收集的？ 如果它們是寄生的 – 記錄它們是從一個(gè)宿主還是多個(gè)宿主收集的。
4.對(duì)寄生蟲來(lái)說(shuō)，最好是讓它們活著幾天并且餓死，這樣不會(huì)讓我們的DNA樣本被宿主污染。
基因組注釋，基因組快速上傳NCBI，生成線粒體基因組組成表，進(jìn)行不同基因起始密碼子/終止密碼子使用的比較分析，制作環(huán)形圖?？梢陨筛鞣N統(tǒng)計(jì)表，比如按分類信息列好的基因組的AT含量、skewness以及參考文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)表；各物種蛋白基因的長(zhǎng)度、起始、終止密碼子統(tǒng)計(jì)生成統(tǒng)計(jì)圖，如一個(gè)或多個(gè)物種的RSCU堆積圖。對(duì)13編碼基因進(jìn)行Ka/Ks分析，計(jì)算各位點(diǎn)核苷酸的多樣性（nucleotide diversity:π），并進(jìn)行滑窗分析。也可視數(shù)據(jù)情況對(duì)非編碼區(qū)分析、串聯(lián)重復(fù)序列多個(gè)（二級(jí)結(jié)構(gòu)），同時(shí)我們還可繪制tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖?？梢詫?shí)現(xiàn)基于線粒體基因組的各種形式的系統(tǒng)發(fā)育分析，按數(shù)據(jù)類型分有核苷酸序列建樹、氨基酸序列建樹；按數(shù)據(jù)分有串聯(lián)蛋白基因、tRNA基因和核糖體rRNA基因建樹；按軟件方法分有NJ樹（MEGA）、ML樹（phyml/raxml）、BI樹（MrBayes）以及異質(zhì)性模型建的貝葉斯樹（phylobayes）；按數(shù)據(jù)處理有去除冗余、去除第三位密碼子、去除異質(zhì)性高的部分以及分區(qū)建樹等?？梢造`活的使用itol進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的美化，比如用顏色和標(biāo)簽標(biāo)記科、總科、目等信息；批量替換物種名字；將每個(gè)物種的基因順序映射到系統(tǒng)發(fā)育樹上；將每個(gè)物種的基因組長(zhǎng)度和AT含量等的條形圖映射到系統(tǒng)發(fā)育樹上。
不同基因起始密碼子/終止密碼子使用的比較分析
環(huán)形圖
線粒體基因組、線粒體各基因、蛋白基因密碼子1，2，3位A、T、C、G含量及AT-skew=[A-T]/[A+T],GC-skew=[G-C]/[G+C]分析及其與其它類群的比較等（多個(gè)）
密碼子分析：密碼子相對(duì)使用頻率（RSCU）條形圖；近緣物種mtDNA在密碼子使用選擇方面的差異比較。
13個(gè)編碼基因的Ka/Ks分析，結(jié)果以圖片形式展示
滑窗分析：計(jì)算各位點(diǎn)核苷酸的多樣性（nucleotide diversity:π），并進(jìn)行滑窗分析。
非編碼區(qū)分析、串聯(lián)重復(fù)序列多個(gè)（二級(jí)結(jié)構(gòu)）（根據(jù)數(shù)據(jù)是否可分析來(lái)決定）
tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖
系統(tǒng)發(fā)育分析（NJ/BI/ML法）
PhyloSuite，一款以流程化、界面化操作方式完成系統(tǒng)發(fā)育分析的工具套件[2]
系統(tǒng)發(fā)育分析，俗稱“建樹”，是科研工作中非常重要的內(nèi)容之一，不管是鑒定新物種或找出不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，都離不開系統(tǒng)發(fā)育分析，可以說(shuō)是“建樹無(wú)處不在”。常規(guī)的操作步驟主要包括多重序列比對(duì)、進(jìn)化模型選擇和系統(tǒng)發(fā)育樹重建等。通常情況下，完成這些流程比較費(fèi)時(shí)，并且不同的步驟大都對(duì)輸入數(shù)據(jù)要求不盡相同，一些關(guān)鍵的參數(shù)設(shè)置還需要根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)進(jìn)行手工調(diào)整，尤其多基因聯(lián)合建樹時(shí)。從獲取數(shù)據(jù)（NCBI下載）到系統(tǒng)發(fā)育樹重建的規(guī)范性以及結(jié)果的可重復(fù)性都是得出嚴(yán)肅科學(xué)結(jié)論的重要前提，這些不僅對(duì)于新手是一個(gè)嚴(yán)峻的考驗(yàn)，對(duì)于老手同樣也不是舉手投足之間可以完成的事。有鑒于此，我們開發(fā)了PhyloSuite。
軟件下載地址：
https://github.com/dongzhang0725/PhyloSuite/releases
參考文獻(xiàn)
[[1]] Zou H, Jakovli? I, Chen R, et al (2017) The complete mitochondrial genome of parasitic nematode Camallanus cotti: extreme discontinuity in the rate of mitogenomic architecture evolution within the Chromadorea class. BMC Genomics 18:840. doi: 10.1186/s12864-017-4237-x
[2]Zhang, D., Gao, F., Li, W.X., Jakovli?, I., Zou, H., Zhang, J., and Wang, G.T. (2018). PhyloSuite: an integrated and scalable desktop platform for streamlined molecular sequence data management and evolutionary phylogenetics studies. bioRxiv, doi: 10.1101/489088.
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