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Crispr/Cas9基因編輯
（CRISPR-Cas9 mediated gene-editing）

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技術(shù)待認(rèn)領(lǐng)

技術(shù)概述

CRISPR-Cas 技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細(xì)胞打靶和 TALEN 等技術(shù)后可用于定點構(gòu)建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉(zhuǎn)移能力強及簡單經(jīng)濟(jì)的特點，在動物模型構(gòu)建的應(yīng)用前景將非常廣闊。
RISPR/Cas9技術(shù)極大方便了基因編輯的操作。利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯，其基本原理為：
第一步先對需要編輯的位點進(jìn)行切割，造成DNA斷裂；
第二步用細(xì)胞的DNA修復(fù)機制對DNA斷裂點進(jìn)行修復(fù)。從而產(chǎn)生需要的突變結(jié)果。
目前主要有兩種方式進(jìn)行基因敲除：通過鄰端接合反應(yīng)敲除目的基因或者通過同源重組敲除目的基因。鄰端接合反應(yīng)的優(yōu)勢在于只需要對DNA切割后，細(xì)胞自身就能修復(fù)。由于不需要重組載體，只需要轉(zhuǎn)入Cas9蛋白和sgRNA就能開始實驗，啟動非?？焖佟Ｍ粗亟M法需要在導(dǎo)入Cas9蛋白和sgRNA的同時，轉(zhuǎn)入同源重組的修復(fù)。

圖1、幾種基因編輯方法比較

（資料來源：諾賽基因，英茂盛業(yè)）

技術(shù)詳情

1、鄰端接合基因敲除

優(yōu)點：
1、只需構(gòu)建一個載體就能開始實驗，啟動快速。
2、實驗設(shè)計簡單。
缺點：
1、突變隨機。后期鑒定工作量大。
2、基因功能缺失對細(xì)胞生長有影響時，很難獲得敲除成功的細(xì)胞。
原理：

工作流程：

（英茂盛業(yè)編輯）

2、重組法基因敲除

優(yōu)點：
1、抗性基因穩(wěn)定整合到基因組中，陽性率很高。
2、篩選較為容易。
缺點：
1、實驗設(shè)計較復(fù)雜。
2、需要同時構(gòu)建基因敲除載體和重組修復(fù)載體，實驗啟動慢。
重組法基因敲除原理

重組法基因敲除流程

（英茂盛業(yè)編輯）

3、重組法定點突變

定點突變是對指定位置的一個或者數(shù)個堿基進(jìn)行精確編輯。定點突變的目的不是基因功能缺失，而是基因功能的改變。
與重組法基因敲除相比，定點突變要求編輯后基因組上不能殘留抗性基因。因此有一定可能未能正確突變的細(xì)胞在篩選中存活。定點突變基因編輯的難度要大于基因敲除。
在我們的pCas9gRNA7基因編輯載體中含有l(wèi)ig4和KU70抑制RNA，可以顯著抑制非重組DNA修復(fù)途徑，極大的提高定點突變成功率。

定點突變原理：