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RNA甲基化免疫共沉淀技術（MeRIP）

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技術待認領

技術概述

甲基化RNA免疫共沉淀 (methylated RNA Immunoprecipitation，meRIP)基于特異性抗體特異性結合甲基化修飾的堿基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修飾片段為基礎，然后通過高通量測序，在全轉錄組范圍內研究發(fā)生甲基化的RNA區(qū)域，獲得結果。

目前己被成功的用于檢測全基因組的RNA甲基化的修飾。其主要的實驗原理為，利用免疫共沉淀的方法即用抗RNA甲基化抗體與被隨機打斷的RNA片段進行孵育，pulldown得到有RNA甲基化修飾的片段，并用于后續(xù)核酸檢測。

（資料來源：伯信生物）

技術詳情

1、數字標簽（UMI）建庫

數字標簽（UMI）建庫是通過數字標簽追溯每一個文庫片段，準確還原樣本原始狀態(tài)，實現(xiàn)絕對化、數字化的精準定量。UMI建庫方法應用于RIP測序，可以降低建庫起始量、解決RIP測序中的堿基偏好性問題、提高input和IP檢測準確度，將RIP測序準確度提升到新的高度。

RNA的修飾通常具有選擇性的，因此MeRIP測序文庫堿基平衡性通常不佳，堿基不平衡導致PCR擴增偏好，并影響文庫構建和最終的測序分析結果。UMI正是解決PCR擴增偏好的方法：

利用UMI追溯reads來源和去重

如上圖所示，UMI建庫測序方法在文庫擴增之前為每一條逆轉錄的cDNA片段加上唯一的身份標簽——UMI，UMI會伴隨片段擴增、測序、分析的全過程。同一個片段經過PCR擴增出來的產物均帶有相同的數字標簽，測序完成后利用UMI追溯每一個片段的來源，將相同來源的片段（具有相同的序列和UMI）進行合并，就能準確去除PCR擴增重復，一比一準確還原樣本擴增前的原始狀態(tài)。

UMI避免了PCR擴增偏好性，因此，在建庫起始量較低的情況下，可增加PCR文庫擴增循環(huán)次數，結合UMI去重糾錯，在不影響準確性的前提下使建庫起始量大大降低，20~50ug RNA即可輕松建庫。

（康測生物編輯）

2、關于m6A研究背景

m6A修飾普遍存在于mRNA 和多種類型的非編碼RNA，通過影響RNA加工成熟、穩(wěn)定性、mRNA運輸與翻譯、RNA編輯等方面，參與腫瘤發(fā)生和轉移、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復和病毒感染等生物學功能和作用機制的研究。相對于研究較早的DNA和組蛋白表觀修飾，近年來發(fā)現(xiàn)，RNA上也存在類似的調控機制。RNA修飾超過150種，N6-methyladenosine (m6A)作為最常見的轉錄后修飾，介導了超過80%的RNA堿基甲基化。這種甲基化修飾非常普遍，其功能由“編碼器Writer”、“消碼器Eraser”和“讀碼器Reader”介導。

RNA N6‐methyladenosine methyltransferase‐like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2‐dependent posttranscriptional silencing of SOCS2[J].?Hepatology, 2018, 67(6):2254.

Writer即甲基轉移酶，在體內和體外催化RNA發(fā)生m6A甲基化修飾，包括METTL3、METTL14和WTAP，VIRMA和RBM15可能也算上。Erasers即去甲基化酶，將RNA甲基化修飾信號擦除，包括ALKBH5和FTO。Readers即可識別RNA甲基化修飾的讀碼器，會參與后續(xù)的RNA翻譯、穩(wěn)定性、剪切和轉運等過程，包括含YTH結構域的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2。

（銳博生物編輯）

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