技術概述
一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質,一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質,必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。
蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異,利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染,而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異,利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。
天然蛋白純化就是從天然樣品中提取較高純度天然蛋白的過程。天然樣品成分復雜,純化過程一般要經過粗提、初步純化和精細純化等步驟。天然蛋白的純化手段包括抽提、沉淀、離心、層析等,高純度天然蛋白可以通過色譜法進行分離制備。
蛋白純化主要方法:
(1)根據分子大小不同的分離方法:透析和超過濾(利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質);密度梯度離心(蛋白質在介質中離心時質量和密度較大的顆粒沉降較快);凝膠過濾(一種柱層析);
(2)利用溶解度差別分離:等電點沉淀法(由于蛋白質分子在等電點時凈電荷為零,減少了分子間靜電斥力,因而容易聚集沉淀,此時溶解度最?。畸}溶與鹽析(利用一定濃度鹽溶液增大或減小蛋白質的溶解度);
(3)根據電荷不同的分離方法,主要包括電泳和離子交換層析分離;
(4)蛋白質的選擇吸附分離(利用顆粒吸附力的強弱不同達到分離目的);
(5)根據配體特性的分離——親和層析(利用蛋白質分子與另一種稱為配體的分子能夠特異而非共價地結合這一生物性質);
(6)低溫有機溶劑沉淀法:用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。
技術詳情
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