氨基酸N端測(cè)序:
目前對(duì)蛋白N端測(cè)序主要分類兩大類,其一為非質(zhì)譜技術(shù),例如經(jīng)典的Edman降解法;其二為質(zhì)譜技術(shù)。
Edman降解法,基本原理包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)或多肽的N-端殘基的偶聯(lián),苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環(huán)化裂解,和噻唑呤酮苯氨(ATZ)轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三個(gè)主要化學(xué)步驟,每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)或多肽裂解一個(gè)氨基酸殘基,同時(shí)暴露出新的氨基酸進(jìn)行下一個(gè)Edman降解,最后用HPLC法鑒定PTH-氨基酸,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。
質(zhì)譜測(cè)序原理是將蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切后,直接用串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定酶切肽段混合物,然后通過一級(jí)質(zhì)譜選擇N端肽段離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析而得到N端序列。能夠?qū)旌系鞍住⒛┒朔忾]或糖基化的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。

氨基酸C端測(cè)序:
蛋白質(zhì)C端測(cè)序3種方法:羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。目前,使用較多的是利用串聯(lián)質(zhì)譜法,其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中會(huì)有規(guī)律的破碎,獲得蛋白質(zhì)肽段的碎片,分析圖譜得到蛋白質(zhì)的C-端序列。
羧肽酶是一種從蛋白質(zhì)C端開始逐個(gè)釋放氨基酸殘基的外切酶。羧肽酶的原理就是通過檢測(cè)羧肽酶逐個(gè)釋放氨基酸的順序來判斷蛋白的C端序列,其中釋放氨基酸的檢測(cè)有兩種:①色譜法-直接檢測(cè)所釋放氨基酸;②質(zhì)譜法-通過測(cè)定蛋白或者多肽原分子量和釋放一個(gè)氨基酸后分子量差值判斷所釋放氨基酸種類,依次類推。
化學(xué)法指蛋白質(zhì)或多肽與化學(xué)試劑反應(yīng)后,專一性的裂解并檢測(cè)C端氨基酸的方法,主要有(異)硫氰酸法和過氟酸酐法。
串聯(lián)質(zhì)譜法是重要檢測(cè)工具,不需要借助專用于C端分析的羧肽酶酶切及化學(xué)裂解,僅用最常用的胰蛋白酶酶切,結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜法也能夠測(cè)定蛋白的C端序列。
(資料來源:丁香園、高彥飛, 王紅霞)