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免疫沉淀（immunoprecipitation）是一種純化蛋白質(zhì)的方法。將目標(biāo)蛋白的抗體與細(xì)胞提取物一起孵育，使抗體與溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)合。然后利用蛋白 A/G 偶聯(lián)的瓊脂糖微珠從溶液中分離出抗體/抗原復(fù)合物，從而將目標(biāo)蛋白質(zhì)從復(fù)雜樣品中分離出來。最后通過 SDS-PAGE 即可分離出樣品用于蛋白質(zhì)印跡分析。

抗體的選擇

多克隆抗體：多克隆抗體因其制備相對(duì)簡(jiǎn)單，可與靶蛋白分子的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，所形成的抗原抗體復(fù)合物較穩(wěn)定因而應(yīng)用的最為廣泛。但多克隆抗體的缺點(diǎn)在于非特異性結(jié)合較多，常會(huì)導(dǎo)致反映本底升高和一定的假陽性結(jié)果。

單克隆抗體：與多克隆抗體相比，單克隆抗體往往只結(jié)合一種抗原表位，具有單一結(jié)合特異性，所以發(fā)生非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)少，可被用于確定靶蛋白上某一部位的特殊結(jié)構(gòu)，甚至可被用于區(qū)分相同靶蛋白的不同形式如構(gòu)象變化和修飾。但反過來，單克隆抗體僅與單一表位結(jié)合的特性也會(huì)引起具有同一表位的不同靶蛋白間的交叉反應(yīng)。??????

對(duì)免疫沉淀和免疫共沉淀而言，抗體與靶蛋白間的作用力最好是剛能達(dá)到分離的效果。結(jié)合力太弱，達(dá)不到分離的目的；反之，結(jié)合力太強(qiáng)，不利用后續(xù)的純化。因此，對(duì)單克隆抗體來說，其與靶蛋白的親合力就顯得尤為重要，通常，親合力小于10????? 7???? M??? －??? 1???? 的抗體就不適于免疫沉淀。

用于免疫沉淀及免疫共沉淀的理想抗體應(yīng)是一組針對(duì)同一靶蛋白分子上不同表位的單克隆抗體的復(fù)合物。同時(shí)，為了保證分離效果，抗體常被事先固定在固相支持物如多聚糖凝膠顆粒Sepharose CL-4B上，或?qū)⒖贵w與無關(guān)的抗免疫球蛋白抗體以及能同免疫球蛋白結(jié)合的蛋白A或蛋白G連接。

免疫沉淀方法

免疫沉淀的靶蛋白一般來自細(xì)胞裂解液，可以是被同位素標(biāo)記的也可以是未被標(biāo)記的。若為前者，免疫沉淀后再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，只需壓片即可檢測(cè)到靶蛋白的存在；若為后者，經(jīng)免疫沉淀和聚丙烯酰凝膠電泳后，尚需借助銀染或免疫印跡進(jìn)行鑒定。

免疫沉淀反應(yīng)

免疫沉淀蛋白質(zhì)可采用幾種不同方法。

第一種方法（方法 A）是先將蛋白質(zhì)樣品與抗體混合，然后加入蛋白質(zhì) A/G 支持。此方法可獲得高純度蛋白質(zhì)；但是，抗體也會(huì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)共洗脫，有時(shí)候會(huì)阻礙蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

第二種方法（方法 B）是將抗體與蛋白質(zhì) A/G 微珠結(jié)合，然后與抗原混合。此方法的產(chǎn)率比前者低，但可避免抗體共洗脫問題。

洗脫

將蛋白質(zhì)從微珠中洗脫出來的方法有三種。SDS 緩沖液的洗脫性最強(qiáng)，還可將非共價(jià)結(jié)合抗體和抗體片段連同目標(biāo)蛋白質(zhì)一起洗脫。另一方面，甘氨酸緩沖液洗脫可輕度洗脫蛋白質(zhì)和少量抗體。尿素緩沖液洗脫由于樣品可被蛋白水解酶消化，因此該方法對(duì)質(zhì)譜測(cè)定具有一定優(yōu)勢(shì)。