熒光能量共振轉(zhuǎn)移
（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）
技術(shù)概述
對于分子生物學(xué)來講，生物分析手段的發(fā)展，是闡明機(jī)理的必要條件。
在研究分子間相互作用的道路上，人們不斷探索，總結(jié)出很多方法，免疫技術(shù)，晶體衍射，核磁共振等。1948年，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）理論被首次提出，它可以測定1.0-6.0nm距離內(nèi)分子間的相互作用。1967年，這一理論得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將1.0-6.0nm的距離稱為光學(xué)尺。二十世紀(jì)八十年代出，通過科學(xué)家的不斷探索，F(xiàn)ret技術(shù)成功運(yùn)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中。自Fret熒光共振能量技術(shù)誕生以來，已結(jié)合多種先進(jìn)的技術(shù)和方法，如電子顯微鏡，X射線衍射等，推動了分子生物學(xué)檢測手段的發(fā)展。
作用原理
熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，是采用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法。他適用于在細(xì)胞正常的生理?xiàng)l件下，驗(yàn)證已知分子間是否存在相互作用。此方法的檢測原理如下；
將我們要檢測的蛋白（如圖X和Y），分別偶聯(lián)上D和A熒光蛋白，D和A是一對熒光物質(zhì)，我們稱之為供體（donor）和受體（acceptor）。當(dāng)用430nm的紫光去激發(fā)X融合蛋白時(shí)，它能夠產(chǎn)生490nm的藍(lán)色熒光；同樣，當(dāng)我們用490nm的藍(lán)光去激發(fā)Y融合蛋白時(shí)，它能夠產(chǎn)生530nm的黃色熒光。（結(jié)合圖1） 。
當(dāng)?shù)鞍譞和Y間沒有相互作用時(shí)（兩者的空間距離>10nm），融合蛋白X和Y分別產(chǎn)生相應(yīng)的熒光而被檢測到，如果蛋白X和Y間存在相互作用（兩者的空間距離需<10nm，結(jié)合圖2），用紫光激發(fā)融合蛋白X其產(chǎn)生的藍(lán)光會被融合蛋白Y吸收，從而產(chǎn)生黃色熒光，這時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)將檢測不到藍(lán)色熒光的存在。這時(shí)因?yàn)槟芰繌腦融合蛋白轉(zhuǎn)移到了Y融合蛋白，這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。
技術(shù)難點(diǎn)
一個(gè)理想的Fret相互作用體系，要求要有一對合適的熒光物質(zhì)， 即供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊。且當(dāng)供體的激發(fā)波長時(shí)對受體無影響，供體和受體的發(fā)射光譜要完全分開，否則容易造成光譜干涉，而使反應(yīng)體系不穩(wěn)定。目前，較為常用的供體-受體分子對，主要有綠色熒光蛋白類（GFPs）和染料類。綠色熒光蛋白類有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料類的有Cy3-Cy5，F(xiàn)ITC-Rhodamine等。且這些熒光物質(zhì)要能夠標(biāo)記在研究對象上。
應(yīng)用要求
供體熒光基團(tuán)和受體熒光基團(tuán)的空間距離要<10nm；
供體的發(fā)射光譜與受體的接收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B；
供體、受體分子在量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。
優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
1.???????? 在活細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下進(jìn)行檢測，觀察大分子在細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)象變化與相互作用，并彌補(bǔ)了需破碎細(xì)胞檢測相互作用的缺點(diǎn)； 2.???????? 靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)對單細(xì)胞水平的研究，研究單個(gè)受體分子； 3.???????? 可與多種儀器和技術(shù)結(jié)合使用，如顯微鏡，色譜技術(shù)，電泳，流失細(xì)胞技術(shù)等； | 1.???????? 應(yīng)用比較局限，一般需要在待檢測分子上偶聯(lián)熒光物質(zhì)（加上標(biāo)記）； 2.???????? 對實(shí)驗(yàn)要求較高，如供受體的光譜重疊不好，會導(dǎo)致熒光干擾，對供受體的抗干擾能力，水溶性等要求高； 3.???????? 需要不斷探索合適的供體和受體，且能夠標(biāo)記分子； 4.???????? 難以觀察瞬時(shí)的分子間作用，檢測要求大量的樣品； |
?細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用
?膜蛋白的研究
?細(xì)胞膜受體蛋白間的相互作用
?細(xì)胞凋亡的研究
?核酸檢測
以熒光物質(zhì)CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測AB蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
1、細(xì)胞培養(yǎng)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)特定的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，觀察檢測分子在細(xì)胞內(nèi)的相互作用；
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：構(gòu)建質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B，將檢測的AB蛋白分別偶聯(lián)上熒光蛋白CFP和YFP，并將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)；
3、檢測 FRET：質(zhì)粒載體CFP-A和YFP-B轉(zhuǎn)染細(xì)胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測，是否發(fā)生Fret；
4、FRET圖像采集： 確定 FRET 配對的激發(fā)波長， 藍(lán)光被調(diào)諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號， 最大供體信號和最小受體信號對應(yīng)的波長用于收集雙表達(dá)細(xì)胞的 FRET信號。調(diào)整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激發(fā)光波長， 采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號。每個(gè)細(xì)胞 FRET 檢測重復(fù) 3 次，每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個(gè)細(xì)胞的 FRET 檢測;
5、FRET 數(shù)據(jù)處理： 去除 FRET 信號中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號； 受體通路的FRET 信號需要對供體受體光譜靈敏度的變化進(jìn)行矯正、對自發(fā)熒光和光學(xué)噪聲進(jìn)行矯正； 利用矯正系數(shù)對雙標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行象素匹配矯正。
技術(shù)詳情
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