技術概述
細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA內切酶,這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測,可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder?;蚪MDNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上 標記的dUTP ,從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測,這就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法檢測細胞凋亡的原理。
對不同組織切片先增加細胞膜通透性,然后讓 rTDT 和生物標記的 dTUTP 進入細胞內,在 rTDT 的輔助下 dTUTP 與核斷裂的 DNA 3’-OH結合,再用 HRP 標記的鏈霉親和素與 dTUTP 上的 biotin 結合(每個鏈霉親和素至少可以再結合 3 個 biotin 分子),最后用 DAB、過氧化氫與 SP 上的辣根過氧化物酶 HRP 發(fā)生氧化、環(huán)化反應,形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色,最終通過計數(shù)每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發(fā)生情況。
技術詳情
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