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技術(shù)概述
siRNA是19-23nt的雙鏈RNA小分子,這種小分子在細胞中首先被一種稱為Dicer的RNA酶切割,隨后與細胞中的某些酶和蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complexes , RISCs),進而解開雙鏈并通過反義鏈與細胞內(nèi)mRNA分子發(fā)生特異性結(jié)合,導(dǎo)致mRNA分子降解,從而抑制特定基因的表達。RNAi技術(shù)已經(jīng)成為功能基因組學研究的有力工具,如應(yīng)用在基因敲除、轉(zhuǎn)基因動物、功能基因組等研究、基因治療及藥物研究等方面。
siRNA合成的方法主要包括:
1、化學合成
2、體外轉(zhuǎn)錄
3、長片斷dsRNA經(jīng)RNaseIII類降解(如Dicer、E.coli、RNaseIII)
4、siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達sirnas
5、pcr制備的siRNA表達框在細胞中表達
前三種方法主要都是體外制備siRNAs,并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。后兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA,依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉(zhuǎn)染到細胞中。每種方法都有有缺點,具體那種方法最好取決于試驗?zāi)康摹?/p>
技術(shù)詳情
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