技術(shù)概述
植物基因工程是以植物為研究對象，按照人們的意愿，將人工分離和修飾過不同生物的目的基因，在生物體外對DNA分子進行經(jīng)過剪切、拼接、修飾和重新組合，然后轉(zhuǎn)到植物受體細胞基因組中，進行組織培養(yǎng)和無性繁殖，使目的基因在受體細胞中復制并表達，引起植物性狀發(fā)生可遺傳的改變。[1]
植物表達載體在植物基因工程中起著至關(guān)重要的作用，構(gòu)建植株表達載體主要目的是將目的基因進行修飾改造，使其轉(zhuǎn)入受體植物后的表達符合目的需要。目前常用于植物基因表達載體構(gòu)建的載體，有過表達載體，干擾載體，啟動子活性分析載體，亞細胞定位載體等。構(gòu)建植物表達載體可以進行基因功能驗證和轉(zhuǎn)基因工程的應(yīng)用。
技術(shù)詳情
將目的基因構(gòu)建到含強啟動子如35S、Lac、Nos等表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA系統(tǒng)，將目的基因整合至植物基因組中，實現(xiàn)目的基因在植物體內(nèi)過量表達，從而進行特定的功能或者表型觀察研究。
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pBI121 | CaMV 35S | GUS | 卡那霉素 | ,新霉素 | 可供構(gòu)建 |
pBI121-mCherry | CaMV 35S | mCherry | 卡那霉素 | 新霉素 | 可供構(gòu)建 |
pBI221-GFP | CaMV 35S | GFP | 氨芐青霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
pBI101 | Lac | / | 卡那霉素 | GUS | / |
pBI121-GFP | CaMV 35S | N-10xHis, N-EGFP，C-6xHis | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pBI221 | CaMV 35S | GUS | 氨芐青霉素 | / | / |
pROKII | CaMV 35S | / | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pCAMBIA1300 | Lac | / | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1301 | CaMV35S,Lac | GUS,6xHis | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1302 | CaMV35S | mGFP5,his | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1301-35S-NOS | CaMV35S | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1300-35S | CaMV35S | ? | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1300-35S-3×Flag | CaMV35S | 3×Flag | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1304 | CaMV35S,Lac | mGFP5,GUS,6×His | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA3301 | Lac，CaMV35S | GUS,6×His | 卡那霉素 | 草丁膦 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1303 | CaMV35S,Lac | mGFP,GUS,6×His | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pCAMBIA1305 | CaMV35S,Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pCAMBIA2300 | Lac | / | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pCAMBIA2301 | Lac | GUS,6×His | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pCAMBIA3200 | Lac | / | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pCAMBIA3201 | Lac | GUS | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pCAMBIA3300 | Lac | / | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pB7WG2 | CaMV35S | / | 氯霉素 | 草丁膦 | / |
pDONR201 | / | ccdB | 卡那霉素/ 氯霉素 | / | / |
pDONR207 | / | ccdB | 卡那霉素/慶大霉素 | / | / |
pDONR221/Kan | T7 | ccdB | 卡那霉素 | / | / |
pDONR221/Zeo | T7 | ccdB | 博來霉素 | / | / |
pEarleyGate100 | CaMV35S | / | 卡那霉素 | 草丁膦 | ? |
pEarleyGate101 | CaMV35S | EYFP,C-HA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pEarleyGate102 | CaMV35S | ECFP,C-HA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pEarleyGate205 | CaMV35S | CBP,TEV,N-2×PortA | 卡那霉素 | 草丁膦 | / |
pENTR3C | / | ccdB | 卡那霉素 | / | / |
pGWB4 | / | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素/遺傳霉素 | / |
pGWB11 | CaMV35S | C-FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素/遺傳霉素 | / |
pGWB12 | CaMV35S | N-FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素/遺傳霉素 | / |
pGWB17 | CaMV35S | C-4×Myc | 卡那霉素 | 潮霉素/遺傳霉素 | / |
pGWB18 | CaMV35S | N-4×Myc | 卡那霉素 | 潮霉素/遺傳霉素 | / |
pK7GWIWG2(I) | CaMV35S | / | 壯觀霉素 | 卡那霉素 | / |
pKGWFS7.1 | / | EGFP,GUS | 氯霉素 | 遺傳霉素 | / |
CRISPR/CAS9是細菌和古細菌為應(yīng)對病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性，當外源核酸入侵時對其靶向定位并降解，首先CRISPR間隔序列獲得和整合，其次CRISPR座的表達，然后CRISPR-CAS9發(fā)揮功能對外源核酸進行干擾,從而對基因位點進行切割導致突變[3]。CRISPR/CAS9技術(shù)在植物研究上主要用于創(chuàng)制植物基因功能缺失突變體，進行基因功能的研究。
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ | CaMV 35S | C-SV40 NLS | 壯觀霉素 | 潮霉素,mCherry | / |
pHDE-35S-Cas9-mCherry | CaMV 35S | C-SV40 NLS | 壯觀霉素 | 潮霉素,mCherry | / |
pCAMBIA1300-pYAO-cas9 | CaMV 35S, YAO | 3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pABS018 | 2×CaMV 35S | 3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
ATU6-26-sgRNA-SK | ATU6-26 | / | 氨芐青霉素 | / | / |
pRGEB32 | Ubi | N-3×FLAG | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
pUC119-gRNA | Lac | / | 氨芐青霉素 | / | / |
pKSE401 | CaMV 35S | 3×FLAG | 卡那霉素 | / | / |
構(gòu)建目的蛋白與熒光蛋白載體N端或者C端融合的過表達質(zhì)粒，通過瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)或者遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，使得該融合蛋白在受體材料細胞內(nèi)表達，目標蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標細胞器中，融合熒光蛋白在掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下發(fā)出熒光，通過觀察熒光蛋白在細胞內(nèi)顯示的位置，從而確定目的蛋白的亞細胞定位情況。目前主要用于亞細胞定位的報告基因是綠色熒光蛋白GFP。
| 載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
| pCAMBIA1300-35S-GFP | CaMV35S | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
| pCAMBIA1300-35S-EYFP | CaMV35S | C-YFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
| 16318h-GFP | 2×CaMV35S | GFP | 氨芐青霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
| pCAMBIA1300-ubi-GFP | UBI | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
| pCAMBIA1300-ubi-htpII-ubi-GFP | UBI | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
| pGreenII-62-SK-EGFP | CaMV35S | C-EGFP | 卡那霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
| pCAMBIA1302 | CaMV35S | C-GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
| pCAMBIA1300-mCherry | CaMV35S | C-mCherry | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
| pHBT-GFP-NOS | CaMV35S | C-GFP | 氨芐青霉素 | / | / |
| pUC35s-mCherry | CaMV35S | mCherry | 氨芐青霉素 | / | / |
熒光素酶（Luciferase）是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，來自于自然界能夠發(fā)光的生物[4]。其中最有代表性的是來自螢火蟲體內(nèi)(Fire?y)和海腎(Renilla)體內(nèi)的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。在熒光素酶的催化下，熒光素底物可以高效的轉(zhuǎn)變成氧螢光素，同時發(fā)出強烈的光。熒光素酶可以高效的檢測基因的表達，是檢驗轉(zhuǎn)錄因子與靶目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)，將目的基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可隆至熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細胞并裂解，通過測定熒光素酶活性，檢測啟動子活性。
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
PCAMBIA1300-EYFP | Lac | EYFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1300-GFP | Lac | GFP | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pGreenII 0800-LUC | CaMV35S | LUC | 卡那霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
pGreenII 0800-miRNA? | CaMV35S | Luc | 卡那霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
pSoup | Lac | / | 四環(huán)素 | / | / |
pGreenII 62-SK | CaMV 35S | / | 卡那霉素 | / | / |
pmir-GLO | PGK | N-Luc2 | 氨芐青霉素 | / | / |
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GUS作為報告基因常用于啟動子的活性分析，既可以瞬時表達分析，又能進行穩(wěn)定遺傳實驗。將目的基因啟動子與GUS融合，可以化學組織染色法對目的基因表達進行定位，也能用熒光定量分析目的基因表達模式。化學組織染色可以了解目的基因在植株不同組織器官的表達，也可以對特定的組織器官染色后做石蠟切片，顯微觀察目的基因產(chǎn)物在組織細胞中的分布特點。[5]
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pCAMBIA1301 | CaMV35S,Lac | GUS,6xHis | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1300-GUS | lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1300-35S-GUS | CaMV 35S | C-GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1381Z | Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | 可供構(gòu)建 |
pCAMBIA1391Z | Lac | GUS | 卡那霉素 | 潮霉素 | / |
雙分子熒光互補 (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)是一項簡單直觀、能夠用于研究體內(nèi)和體外蛋白質(zhì)相互作用及目的蛋白在細胞中定位的一種技術(shù)。將熒光蛋白在某些特定的位點切開，形成不發(fā)熒光的N和C端2個多肽，稱為N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。這2個片段在細胞內(nèi)共表達或體外混合時，不能自發(fā)地組裝成完整的熒光蛋白，在該熒光蛋白的激發(fā)光激發(fā)時不能產(chǎn)生熒光。但是，當這2個熒光蛋白的片段分別連接到1組有相互作用的目標蛋白上，如果目標蛋白質(zhì)之間有相互作用，則在激發(fā)光的激發(fā)下，產(chǎn)生該熒光蛋白的熒光，反之若蛋白質(zhì)之間沒有相互作用，則不能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。[6]
載體 | 啟動子 | 報告基因/標簽 | 原核抗性 | 篩選標記 | 備注 |
pUC-SPYNE | CaMV35S | C-myc,YFP-N | 氨芐青霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
pUC-SPYCE | CaMV35S | C-HA,YFP-C | 氨芐青霉素 | / | 可供構(gòu)建 |
pSPYNE-35S | CaMV35S | C-myc,YFP-N | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pSPYCE-35S | CaMV35S | C-HA,YFP-C | 卡那霉素 | 新霉素 | / |
pSAT1-cEYFP-N1 | CaMV35S | YFP-C | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT1-nEYFP-C1 | CaMV35S | YFP-N | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT4-cEYFP-N1 | CaMV35S | YFP-C | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT4-nEYFP-C1 | CaMV35S | YFP-N | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT6-cEYFP-N1 | 2×CaMV35S | YFP-C | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT6-nEYFP-C1 | 2×CaMV35S | YFP-N | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT6-RFP-N1 | CaMV35S | RFP-N1 | 氨芐青霉素 | / | / |
pSAT6-RFP-C1 | CaMV35S | RFP-C1 | 氨芐青霉素 | / | / |
pEarleyGate201-YN | CaMV35S | HA,YFP-N | 卡那霉素 | / | / |
pEarleyGate202-YC | CaMV35S | FLAG,YFP-C | 卡那霉素 | / | / |
BIFC載體網(wǎng)站：https://www.bio.purdue.edu/people/faculty/gelvin/nsf/protocols_vectors.htm
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參考文獻
1. 李瑞國. 植物基因工程技術(shù)及其發(fā)展[J]. 邢臺學院學報, 2003,18:83-85
2. 王婷婷等. RNA干擾及其在植物研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報, 2013, 3:48-52
3. Marraffini LA et al.?CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea [J]. Nat Rev Genet, 2010, 11:181-190
4. 杜彥艷等. 報告基因熒光素酶在科研中的應(yīng)用[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2009, 16: 715-718
5. 楊丹丹等. GUS報告系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2014, 30: 761-768
6. 樊晉宇等. 雙分子熒光互補技術(shù)[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2008, 24: 764-774
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