染色體步移技術(shù)概述
染色體步移技術(shù)（Chromosome walking）又稱為基因組步移（Genome Walking），指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列，逐步探知其相鄰未知序列或與已知序列成線性關(guān)系的目標(biāo)序列的方法[1]。
染色體步移技術(shù)主要分為結(jié)合基因組文庫的染色體步移技術(shù)和基于PCR擴增的染色體步移技術(shù)。結(jié)合基因組文庫的染色體步移技術(shù)是先用遺產(chǎn)學(xué)分析確定目的基因所在染色體大致位置，然后應(yīng)用與之連鎖的遺傳標(biāo)志作為分子探針，從基因文庫中篩出與此標(biāo)志的5’端和3’端部分重疊的DNA克隆，在已篩得的DNA克隆去篩選與它們鄰接的DNA克隆，最后利用生物學(xué)性質(zhì)和測序方法確定尋找的目的基因[2]，適合長距離步移?；赑CR擴增的染色體步移技術(shù)步移距離短，適合已知一段核苷酸序列進行的染色體步移，主要有連接成環(huán)PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR和半隨機引物PCR。熱不對稱PCR反應(yīng)（Thermal asymmetric interlaced，TAIL-PCR）又叫巢式PCR，是半隨機引物PCR中應(yīng)用最廣。
染色體步移技術(shù)主要應(yīng)用于鑒定T-DNA或轉(zhuǎn)座子的插入位點，鑒定轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)致的外源基因的插入位點；根據(jù)基因的已知片段、EST或插入的轉(zhuǎn)座子序列克隆目的基因，分離基因的啟動子及調(diào)控元件；用于人工染色體PAC、YAC和BAC的片段搭接；構(gòu)建圖位克隆中的重疊群；轉(zhuǎn)化標(biāo)記輔助育種中的STS或SCAR標(biāo)記等。[3]
技術(shù)詳情
以基因組DNA為模板，根據(jù)已知DNA序列，分別設(shè)計3條同向且退火溫度較高的嵌套特異引物（Special primer，SP），與一個較短且退火溫度較低的隨機兼并引物（AP）組合，進行3輪TAIL-PCR，進行擴增，獲得已知序列的側(cè)翼序列（圖1）。
圖1?TAIL-PCR原理（圖片來源：https://www.takarabiomed.com.cn）
圖2 Genome Walking實驗流程（圖片來源：轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實驗室有限公司）
DNA提取確保模板無污染；引物設(shè)計；巢式PCR反應(yīng)。
（1）模板DNA不要污染，動物和植物所需基因組DNA為0.1-1 μg，微生物所需基因組10-100 ng。
（2）特異嵌套引物與簡并引物的退火溫度至少相差10℃；設(shè)計3個SP引物，引物長度為22-26 bp，GC含量45-55%，退火溫度為60-70℃；引物SP2設(shè)計位置在SP1內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2內(nèi)側(cè)，這3條引物分別是第1到第3輪反應(yīng)的下游引物，AP為上游引物；根據(jù)物種保守氨基酸序列設(shè)計兼并引物AP，長度為14 bp，退火溫度為40℃。
（3）SP引物保持較低濃度，AP引物濃度高為2.5-5.0 pmol/μL，進行3次TAIL-PCR反應(yīng)使用的AP引物為同種AP引物。
（4）第1輪PCR結(jié)束，將PCR產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)（1-1000）后取1 μL作為第2輪擴增的模板，第2輪的PCR產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)（1-1000）后取1 μL作為第3輪的模板；第2輪擴增和第3輪擴增的PCR產(chǎn)物同時進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小，第3輪擴增條帶大小比第2輪擴增小。
（5）第3輪擴增的PCR產(chǎn)物切膠回收純化，以SP3為引物進行測序。
Q1：第一輪PCR擴增常常出現(xiàn)較多非特異擴增？
A1：是通用引物AP引起的單引物非特異擴增，PCR反應(yīng)采用梯度退火程序；延伸時間長更容易產(chǎn)生非特異擴增，應(yīng)適當(dāng)縮短延長時間；后面通過第2輪和第3 輪PCR擴增提高產(chǎn)物的特異性。
Q2：高等植物步移過程中出現(xiàn)高級結(jié)構(gòu)AT含量高，無法進行步移？
A2：更換SP引物位置；更換好的Genome Walking試劑盒進行步移擴增。
Q3：獲取的側(cè)翼序列測序有套峰？
A3：可能是非特異性擴增或PCR產(chǎn)物不純，DNA結(jié)構(gòu)本身復(fù)雜，需要重新設(shè)計測序引物或者克隆測序。
Q4：Genome Walking試劑盒中所有的AP引物都沒有擴增出新清晰條帶？
A4：若第2輪和第3輪PCR無清晰條帶，應(yīng)擴大模板的稀釋倍數(shù)；可能基因組模板中有抑制PCR反應(yīng)物質(zhì)，減少基因組模板的使用量或重新提取純化基因組DNA；重新設(shè)計SP引物。
優(yōu)點：操作簡單、快速高效、特異性高、反應(yīng)產(chǎn)物準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等。
缺點：反應(yīng)條件精細(xì)，進行3輪連續(xù)嵌套反應(yīng)，任何一輪都會影響結(jié)果；需要較多的引物組合；反應(yīng)不是每次都有陽性結(jié)果，第一輪擴增常常為非特異性擴增。
PCR產(chǎn)物或TA克隆測序結(jié)果；擴增膠圖或菌落PCR膠圖。
相關(guān)試劑：DNA提取相關(guān)試劑；PCR產(chǎn)物膠回收試劑；Genome Walking提取試劑盒等。
相關(guān)儀器：PCR儀，紫外照膠儀，離心機，超凈工作臺等。
1. 趙壽元. 英漢遺傳工程詞典(第二版). 上海: 復(fù)旦大學(xué)出版社,1999, 48.
2. 方福德. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)詞典[M]. 北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社, 1995,67.
3. 梁成真等. 染色體步移技術(shù)研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2009, 10: 75-82.
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染色體步移得到片段怎么判斷內(nèi)含子