技術概述
在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用研究的是原核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng)是將外源cDNA片段克隆到原核表達載體上然后轉(zhuǎn)化表達菌株，在原核生物來表達外源蛋白的系統(tǒng)[1]，主要包括大腸桿菌表達、枯草芽孢桿菌表達、鏈霉素表達等。原核表達載體是能攜帶插入外源基因序列進入原核細胞中進行表達的載體。目前應用最為廣泛的原核表達載體是大腸桿菌表達載體，一般說的原核表達系統(tǒng)主要是指大腸桿菌表達。大腸桿菌表達載體主要有PET系列、PGEX系列和PQE系列。應用最多的是PET系列，它能在大腸桿菌中高效且高產(chǎn)的表達外源蛋白[2]。原核表達系統(tǒng)主要用途：基因功能研究、重組蛋白特性研究、重組蛋白制備/制藥。
原核表達系統(tǒng)優(yōu)點：大腸桿菌遺傳背景清楚、生長繁殖快、轉(zhuǎn)化效率高、經(jīng)濟實惠、能快速大量生產(chǎn)目的蛋白[3]。原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低。[1]
技術詳情
載體 | 啟動子 | 報告基因 | 抗性 | 表達宿主 | 備注 |
pET3a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET3b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET3c | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET5a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET5b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET9a | T7 | N-T7 | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET11a | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET11b | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET11c | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET11d | T7,Lac | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET14b | T7,AmpR, | N-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET15b | AmpR,Lac1 | N-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET17b | T7 | N-T7 | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET19b | AmpR,Lac1 | N-His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET20b | T7,AmpR, | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET21(+) | AmpR,Lac1 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET21a | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET21b | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET21c | AmpR,Lac1 | N-T7,C-6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET21d | T7 | N-T7,C-His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET22b | T7,AmpR,Lac1 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET23(+) | T7 | C-His,N-pelB | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET26b | T7 | C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET28a | T7 | N-6×His,N-Thronbin,N-T7,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET28a-Spy | T7 | N-Spy,N–6×His,N-Thronbin,N-T7,C–6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET28a-SUMO | T7/Tac | N-6×His,N-Thrombin,,N-SUMO,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET30a | T7 | N-6×His,N-Thrombin,N-S,N-EK,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET32a | T7/Tac | N-Thrombin,C-6×His和中間6×His | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET42a | T7/Lac | N-GST,N-S,N-His,N-Thrombin,N-HRV,C-6×His | 卡那霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | 可供構建 |
pET16b | T7,Lac | N-10×His, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21（DE3）等大腸桿菌 | / |
pTrc-CKS | Trc | N-CKS,C-6×His，N-P3C | 氨芐青霉素 | BL21(DE3)等大腸桿菌 | / |
載體 | 啟動子 | 報告基因 | 抗性 | 表達宿主 | 備注 |
pGEX-4T-1 | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | 可供構建 |
pGEX-6P-1 | Tac/lac | N-GST，N-PP/3C | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | 可供構建 |
pGEX4T-1-6×His | Tac | N-GST,C-His,N-ttrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | 可供構建 |
pGEX-4T-2 | Tac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-4T-3 | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-1 | Tac/lac | N-GST，N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-6P-2 | Tac/lac | N-GST, N-PP/3C | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-6P-3 | Tac/lac | N-GST, N-PP/3C | 氨芐青霉素 | BL21等大腸桿菌 | / |
pGEX-KG | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-3 | Tac/lac | N-GST | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-2T | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-1λT EcoRI/BAP | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-5X-2 | Tac/lac | N-GST, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-3X | Tac/lac | N-GST,?N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-2TK | Tac/lac | N-GST, N-thrombin | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
pGEX-His | Tac/lac | N-GST, C-His | 氨芐青霉素 | 大腸桿菌 | / |
載體 | 啟動子 | 報告基因 | 抗性 | 表達宿主 | 備注 |
pQE30 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | 可供構建 |
pQE40 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | 可供構建 |
pQE2 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE9 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE31 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-32 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-70 | T5 | C-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-80L | T5 | N-6×His,Nterm, lacIq | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-31 | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem-7 | p10 | C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem-5 | p10 | C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-TriSystem His-Strep2 | p10 | HSV,C-8×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-T7-1 | T7 | N-10×His,C-6×His | 卡那霉素 | M15 | / |
pQE-T7 | T7 | N-6×His,C-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-100 DoubleTaq | T5 | N-6×His,Tag-100 | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pQE-82L-Kan | T5 | N-6×His | 卡那霉素 | M15 | / |
pQE-82L | T5 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-A | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-B | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
pRSET-C | T7 | N-6×His | 氨芐青霉素 | M15 | / |
載體 | 啟動子 | 報告基因 | 抗性 | 表達宿主 | 備注 | ? | |
pMal-p5X | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c5X | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c4X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p2X | Tac | N-MBP，N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c2X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-c2E | Tac | N-MBP, N-EK | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p2G | Tac | N-MBP, N-Genenase I | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p4X | Tac | N-MBP, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
pMal-p5E | Tac | N-MBP | 氨芐青霉素 | BL21 | / | ||
載體 | 啟動子 | 報告基因 | 抗性 | 誘導方式 | 備注 |
pCold I | cspA | N-His, N-Factor Xa | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | 可供構建 |
pCold-ZZ | CSPA | N-His,?N-Factor?Xa，N-ZZ | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | 可供構建 |
pCold-Sumo | CSPA | N-SUMO | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | 可供構建 |
pColdII | CSPA | N-His | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | / |
pColdIII | CSPA | / | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | / |
pColdTF | CSPA | N-His,?N-Trigger, N-Thrombin, N-Factor Xa，N-HRV?3C | 氨芐青霉素 | 溫度誘導 | / |
克隆菌株用于擴增大量質(zhì)粒，原核載體克隆菌通常是K12系列NovaBlue，JM109及DH5ɑ，這些菌是recA-endA?型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。
表達菌株是用于表達蛋白，原核載體表達菌是帶有染色體T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌，包括所有B型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta 及Tuner，目前BL21（DE3）用得最多的表達菌。
參考文獻
1. 陳曉娟等. 蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 包頭醫(yī)學院學報, 2014, 30: 142-143.
2. 祁浩等. 大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2016, 44: 4-6.
3. Mergulha?o FJM et al. Recombinant protein secretion in Escherichia coli [J]. Biotechnology Advances, 2005, 23:177-202.
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設計原核表達載體時，連不上是什么原因