技術(shù)概述
蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究蛋白間相互作用的一種有效技術(shù)手段。轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA 結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由其上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域，即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)共同完成的。
以Gal4 系統(tǒng)為例，BD和AD 分別由Gal4 蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa 與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4 系統(tǒng)篩選cDNA 文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即”誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD 可以與GAL4 上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD 則不能與GAL UAS 結(jié)合；只有當(dāng)BD 與 AD 分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD 與AD 才能與 GAL UAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。
技術(shù)詳情
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如果手上有比較大量的純度比較高的蛋白質(zhì)的話?？梢試L試用以下比較直接的方法：1. isothermal titration calorimetry （ITC），直接測定兩個蛋白互相作用的Kd值。2. AUC，也就是超速離心分析?？梢灾苯訙y定兩個蛋白相互作用與否。3.SAXS, 也就是X-ray小角散亂。不過技術(shù)難度比較大一些。4. 溶液NMR，這個應(yīng)該可以但不太了解。5. 結(jié)晶再解構(gòu)，這個不用解釋了。比較究極一點。6.cryo-EM，同上。比較究級的方法。7. 最簡單常用的，gel-filtration，觀察有沒有oligomer的分子量峰出現(xiàn)。但是相互作用弱的話很難觀測到。8.更簡單常用的nativePAGE，同上，相互作用弱則很難觀測到。9.用氨基架橋試劑共價連接，然后SDS-PAGE?？纯从袥]有oligomer的帶。暫時想到這些，跨度比較大。