技術(shù)概述
定點(diǎn)突變（Site-directed mutagenesis，SDM）是指按照人們的意愿在體外對(duì)基因的特定編碼區(qū)和表達(dá)調(diào)控區(qū)定向發(fā)生缺失、插入或堿基替換等變異過(guò)程。體外定點(diǎn)突變的方法有寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變和盒式突變[1]。寡核苷酸定點(diǎn)突變指用含有突變堿基的寡聚核酸片段為引物，在聚合酶的作用下啟動(dòng)DNA分子進(jìn)行復(fù)制，合成新的有突變堿基序列的DNA新鏈。盒式突變又稱為片段取代法，是用一段人工合成具有突變序列的寡核苷酸片段，變性退火后產(chǎn)生粘性末端，取代野生型基因中相應(yīng)序列[2]。PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變主要采用重組PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，首先通過(guò)引物設(shè)計(jì)在擴(kuò)增片段的末端引入錯(cuò)配堿基，再通過(guò)重疊延伸PCR（Splicing by overlap extension PCR，SOE PCR）將兩個(gè)末端相互重疊且都含有相同突變的片段進(jìn)行拼接，將突變位點(diǎn)導(dǎo)入擴(kuò)增片段的內(nèi)部[3]。定點(diǎn)突變技術(shù)根據(jù)突變位點(diǎn)數(shù)目又分為單點(diǎn)突變和多重突變。
基因的定點(diǎn)突變主要應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能[4]；改造啟動(dòng)子或DNA作用元件[4]；識(shí)別或改造酶的活性位點(diǎn)；提高蛋白的抗原性、穩(wěn)定性和晶體研究[5]；藥品的研發(fā)及基因治療[5]等。
技術(shù)詳情
定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。
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設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物和擴(kuò)增突變基因全長(zhǎng)引物→準(zhǔn)備模板DNA→PCR擴(kuò)增突變位點(diǎn)及兩側(cè)序列→用酶消化PCR產(chǎn)物中的甲基化質(zhì)粒→回收兩端PCR片段→重組PCR→轉(zhuǎn)化→菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆→測(cè)序分析。
定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)；PCR反應(yīng)；DpnI酶處理PCR產(chǎn)物。
（1）設(shè)計(jì)同一方向完全互補(bǔ)的定點(diǎn)突變引物，長(zhǎng)度為 25-45?bp，一般都是以要突變的堿基為中心，各加上兩邊的長(zhǎng)度至少為 10–15?bp的一段序列；突變引物GC含量應(yīng)大于40%，Tm ≥78℃且引物的3’端以G或C結(jié)束。
（2）定點(diǎn)突變引物用高核苷酸液相色譜（FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行純化。
（3）不使用普通的Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)闀?huì)在PCR產(chǎn)物的3’端加A，會(huì)導(dǎo)致拼接片段產(chǎn)生移碼突變，為了防止產(chǎn)生新的突變，使用高保真DNA聚合酶（如Pfu聚合酶等）。
（4）用DpnI酶處理PCR產(chǎn)物中甲基化質(zhì)粒模板，處理時(shí)間至少一個(gè)小時(shí)將甲基化質(zhì)粒去除干凈。
（5）PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，回收的PCR產(chǎn)物等濃度混合，作為擴(kuò)增定點(diǎn)突變?nèi)L(zhǎng)的模板。
（6）GC含量高的復(fù)雜模板，可以加入2%-8%的DMSO提高反應(yīng)效率。
Q1：轉(zhuǎn)化后平板上沒(méi)有菌落或菌落數(shù)少？
A1：感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低，確保轉(zhuǎn)化效率在108?cfu/μg以上；DpnI酶消化的產(chǎn)物用乙醇沉淀純化，用少量的水溶解；轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中的DpnI消化產(chǎn)物少，提高轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞PCR產(chǎn)物的量；抗生素濃度高，使用適當(dāng)濃度的抗生素。
Q2：PCR產(chǎn)物凝膠電泳沒(méi)有條帶？
A2：檢查引物是否設(shè)計(jì)錯(cuò)誤；選擇溫度梯度退火，尋找最適退火溫度；確保模板DNA的完整，提高PCR反應(yīng)體系中模板的量或優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。
Q3：樣品誘變效率低？
A3：使DpnI酶消化PCR產(chǎn)物時(shí)間充足，延長(zhǎng)消化處理時(shí)間，確保擴(kuò)增中的原始模板被降解。
Q4：測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與設(shè)計(jì)不符？
A4：確定模板是否攜帶未知突變；引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，重新設(shè)計(jì)引物并提高退火溫度。
Q5：轉(zhuǎn)化后平板上的菌落多？
A5：DpnI酶消化PCR產(chǎn)物時(shí)間短，DpnI消化不完全，含有未突變的模板，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間；抗生素失效，重新配置培養(yǎng)基并選擇適當(dāng)濃度的抗生素。
Q6：PCR產(chǎn)物有雜帶無(wú)法確定目的條帶？
A6：優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，提高退火溫度，增加特異性；適當(dāng)降低PCR反應(yīng)延伸時(shí)間；適當(dāng)減少模板的量。
PCR膠圖；測(cè)序結(jié)果等。
比較 | 寡核苷酸定點(diǎn)突變 | PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 | 盒式突變 |
優(yōu)點(diǎn) | 保真度高 | 操作簡(jiǎn)單、成功率高 | 簡(jiǎn)單易行、突變效率高 |
缺點(diǎn) | 操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)；在克隆待突變基因時(shí)會(huì)受到限制性酶切位點(diǎn)的限制 | DNA片段定點(diǎn)突變后續(xù)工作復(fù)雜，需要連到載體分子上才能對(duì)突變基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯等研究；質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，不能確定質(zhì)粒載體上有無(wú)突變。 | 需合成多條引物，成本高；靶DNA?序列的兩側(cè)需要有合適的酶切位點(diǎn)。 |
試劑：質(zhì)粒提取試劑盒；基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖校荒z回收試劑盒等。
儀器：PCR儀；離心機(jī)；紫外照膠儀；超凈工作臺(tái)等。
1. 張浩等. 定點(diǎn)突變技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志, 2000, 16: 108-110
2. 張寶中等. 用DREAM技術(shù)進(jìn)行全長(zhǎng)質(zhì)粒快速定突變[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25: 306-312
3. 李海濤等. 豬TLR5基因定點(diǎn)突變表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 43: 11-15
4. 戴燦等. 基于重疊延伸PCR法的定點(diǎn)突變技術(shù)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 10: 411-412
5. 嚴(yán)婉榮等. 3種基因突變方法在微生物中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28: 179-184
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