雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強(qiáng)，易于檢測；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個(gè)或幾個(gè)克隆序列組成。

探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時(shí)步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。

1. 實(shí)驗(yàn)用具及材料
2. 相關(guān)溶液的配制

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g檸檬酸鈉，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。

（2）去離子甲酰胺（DF）：將10 g混合床離子交換樹脂加入100 mL甲酰胺中。電磁攪拌30 min，用Whatman l號濾紙濾。

（3）體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

（4）體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

（5）體積分?jǐn)?shù)50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

（6）雜交液：8 μL體積分?jǐn)?shù)25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL體積分?jǐn)?shù)50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH₂O混合）取上述混合液50 μL，與5 μL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10% DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50% DF。

（7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL雙蒸水，使終濃度為2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO₃調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

（9）封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH₂O 1mL，Tween20 5 μL混合。

（10）封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH₂O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH₂O 3mL，Tween20 5μL混合。

（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

二、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1. 探針變性

將探針在75℃恒溫水浴中溫育5 min，立即置0℃，5～10 min，使雙鏈DNA探針變性。

2. 標(biāo)本變性

（1）將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3 h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70% 甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5 min，然后空氣干燥。

3. 雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過夜（約15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。

4. 洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5 min。

（3） 在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5 min。

（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下。

（5） 取出玻片，自然干燥。

（6） 取200 μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

5. 雜交信號的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加150 μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。

（2） 去掉保鮮膜，再加150 μL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40 min。

（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5 min。

（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150 μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20 min。

（5） 去掉保鮮膜，加150 μL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40 min。

（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5 min。

（7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。

（8） 取出玻片，自然干燥。

（9） 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

6. 封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

7. 熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490 nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長及濾光鏡選擇