來(lái)源：MATER METHODS 2012;2:134? | 分類：技術(shù)專題 |? 翻譯：聚生物 | 2019-10-31

Caroline Ritchie (Caroline dot ritchie103, gmail . com)，美國(guó)愛(ài)荷華州立大學(xué)

DOI： //dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.134

Date：last modified : 2019-10-23; original version : 2012-11-17

Cite as： MATER METHODS 2012;2:134

摘要:對(duì)蛋白質(zhì)純化柱色譜技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

 

純化蛋白是許多實(shí)驗(yàn)應(yīng)用所必需的，包括蛋白結(jié)構(gòu)研究和體外生化分析。蛋白質(zhì)可以從組織中獲得，或者更多的是通過(guò)它們?cè)谀Ｐ蜕矬w中的過(guò)度表達(dá)獲取，如培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。蛋白質(zhì)純化包括根據(jù)蛋白質(zhì)物理性質(zhì)的差異，從來(lái)源中分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)純化方案的目的是用最少的污染物保留最大量的功能蛋白。必須優(yōu)化蛋白質(zhì)的純化方案，以便在最少的步驟內(nèi)完成這一過(guò)程。

圖1 ?Tris緩沖溶液含有Tris堿和它的共軛酸。Tris在25℃時(shí)的pKa為8.06，這說(shuō)明在pH = 8.06時(shí)，50%的Tris被質(zhì)子化(呈酸性)，50%被去質(zhì)子化(呈堿性)。

本文綜述了蛋白質(zhì)純化中常用的四種柱層析方法，并討論了它們的優(yōu)缺點(diǎn)和可能存在的問(wèn)題。本文還報(bào)道了Labome對(duì)98種出版物的調(diào)查。調(diào)查表明，親和柱層析法是文獻(xiàn)中引用的主要方法，主要基于HIS、GST、FLAG tags、size exclusion等。GE醫(yī)療是用于蛋白質(zhì)純化的試劑和儀器的主要供應(yīng)商。

開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)純化方案

在開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)純化方案時(shí)，最重要的考慮因素是純化后的蛋白質(zhì)的下游應(yīng)用。蛋白質(zhì)的數(shù)量和純度必須足以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。此外，必須考慮有關(guān)蛋白質(zhì)功能信息，因?yàn)檎郫B良好和功能完整的蛋白是下游研究所需。在純化和隨后的貯藏過(guò)程中，可能會(huì)發(fā)生許多影響蛋白質(zhì)質(zhì)量的過(guò)程:蛋白質(zhì)的展開(kāi)、聚集、降解和功能喪失。在最穩(wěn)定的條件下，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行盡可能快的純化，將使純化方案的能夠最大化的成功。

緩沖系統(tǒng)

蛋白質(zhì)在純化過(guò)程中每一步的溶解條件對(duì)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要。蛋白質(zhì)應(yīng)該被保存在一個(gè)緩沖良好的環(huán)境中，以防止pH值的突然變化不可逆轉(zhuǎn)地影響其折疊、溶解性和功能。

緩沖液是含有共軛酸堿對(duì)的溶液。緩沖液的p H值范圍基于其pK_a，定義為50%的分子呈酸性，50%的分子呈堿性（圖1）。有關(guān)緩沖液的一般規(guī)則是，緩沖液的pH值應(yīng)在1.0ph單位內(nèi)，以提供適當(dāng)?shù)木彌_容量。這確保了在H⁺或OH^-流入的情況下，有足夠數(shù)量的酸性和堿性分子中和溶液。因此，緩沖液可以防止pH值的變化，從而對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖2. Aktaprime plus系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)的自動(dòng)色譜分離。圖片來(lái)源：GE。

一個(gè)好的緩沖器必須具備以下特點(diǎn)：

1.水溶性

2.化學(xué)穩(wěn)定性

3.在所需的pH值具備高緩沖能力

4.與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的兼容性

5.與其他解決方案的兼容性

圖3?Ni-NTA配體共價(jià)連接到交聯(lián)的瓊脂糖基質(zhì)上，用于選擇性純化多組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。組氨酸殘基可以通過(guò)取代結(jié)合水分子(用紅色箭頭表示)與Ni²⁺離子配位。然后，咪唑或游離組氨酸可以通過(guò)與Ni²⁺離子配合和取代結(jié)合蛋白的能力來(lái)洗脫蛋白。圖片來(lái)源：BioKe。

許多成分可以作為生物緩沖液。最常用的緩沖成分具有接近中性的pKa，因?yàn)樗鼈兛梢栽谏韕H值下使用。表1列出了四種最常用的生物緩沖液，以及它們可以使用的pH值范圍，以及可能影響它們?cè)诘鞍踪|(zhì)純化中使用的優(yōu)缺點(diǎn)。通常，這些緩沖液的濃度高于mM，以確保足夠的緩沖能力。

表1 最常用的蛋白純化生物緩沖液。緩沖液在特定的pH值范圍內(nèi)保持緩沖能力，某些緩沖成分的特性可能會(huì)干擾特定的色譜程序或分析。總結(jié)自Promega, millipoma, Applichem, Embl.de。

Buffer	pH range	Advantages and Disadvantages
Phosphate	5.8-8.0	pH is not dependent on temperature Inexpensive Transparent in the UV range Cannot be used with divalent cations Some proteins may precipitate with sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer can be used.
MOPS	6.5-7.9	Cannot be autoclaved pH is somewhat dependent on temperature High buffering capacity at physiological pH
HEPES	6.8-8.2	Cannot be autoclaved pH is somewhat dependent on temperature Can form radicals under certain conditions [2]
Tris	7.5-9.0	pH is dependent on temperature and dilution Inexpensive Can interfere with the activity of some enzymes [3], [4] Transparent in the UV range

純化溶液添加物

除了適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)外，在蛋白質(zhì)從裂解到儲(chǔ)存的純化過(guò)程中使用的溶液通常含有許多其他成分，這些成分在促進(jìn)蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和功能方面起著作用。

蛋白酶抑制劑常被添加到裂解緩沖液和純化方案的早期步驟中，以防止內(nèi)源性蛋白酶降解目標(biāo)蛋白。這些通常在純化的后期不需要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)或所有的污染蛋白酶已經(jīng)從相關(guān)蛋白中分離出來(lái)。金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，常被添加到存儲(chǔ)緩沖液中。這些金屬螯合劑與Mg²⁺結(jié)合，從而通過(guò)污染金屬蛋白酶防止純化蛋白的裂解。其他添加劑常用于保護(hù)蛋白質(zhì)不受損害和增強(qiáng)其溶解性。

表2 常用于蛋白質(zhì)純化緩沖液中的添加劑，以增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?？偨Y(jié)自Thermo Fisher Pierce和EMBL.de。

Type	Function	Commonly Used Reagents
Reducing Agents	Protect against oxidative damage	2-mercaptoethanol?(BME) Dithiothreitol?(DTT) Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)
Protease Inhibitors	Inhibit endogenous proteases from degrading proteins	Leupeptin?(serine and cysteine protease inhibitor) Pepstatin A?(aspartic acid protease inhibitor) PMSF?(serine protease inhibitor)
Metal Chelators	Inactivate metalloproteases	EDTA EGTA
Osmolytes	Stabilize protein structure and enhance solubility	Glycerol Detergents?(e.g., CHAPS, NP-40, Triton X-100) Sugars (e.g., glucose, sucrose)
Ionic Stabilizers	Enhance solubility	Salts (e.g., NaCl, KCl, (NH4)2SO4

只有在必要時(shí)才應(yīng)使用添加劑。通常需要反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定有利于特定蛋白質(zhì)純化方案時(shí)使用添加劑。

其他注意事項(xiàng)

在純化過(guò)程中，其他因素也有助于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中，最少的操作總是最好的。設(shè)計(jì)一個(gè)在最短時(shí)間內(nèi)使用最少步驟的純化方案，確保功能蛋白的最高產(chǎn)量。此外，在整個(gè)純化過(guò)程中保持蛋白質(zhì)的低溫通常是最好的。通常，純化是在4℃下進(jìn)行的，因?yàn)檩^低的溫度既減慢了蛋白質(zhì)分解的速度（在有污染蛋白酶的情況下），又促進(jìn)了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。

表達(dá)系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)純化的影響

在純化感興趣的蛋白質(zhì)之前，必須制備初始的粗樣品。首先要考慮的是所需蛋白質(zhì)的來(lái)源，這在實(shí)際純化之前就已經(jīng)發(fā)生了。這可能是一種天然來(lái)源，如肝臟、肌肉或腦組織，但在后基因組領(lǐng)域，研究人員從天然來(lái)源純化蛋白質(zhì)的情況相對(duì)較少。然而，如果研究者希望將催化活性與特定蛋白質(zhì)序列聯(lián)系起來(lái)，有時(shí)仍有必要的。

如今，從重組源中純化蛋白質(zhì)的情況要普遍得多。需要提前做出重要決定，以優(yōu)化后續(xù)凈化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的最終用途（如酶分析、結(jié)構(gòu)研究、抗體生成），因?yàn)檫@將決定最終蛋白質(zhì)制備所需的數(shù)量和純度。一個(gè)重要的考慮因素是表達(dá)系統(tǒng)的選擇（見(jiàn)Labome文章重組蛋白表達(dá)：載體宿主系統(tǒng)）以討論基于文獻(xiàn)的無(wú)偏調(diào)查的最廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)。雖然對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出了本文的范圍，但在這一點(diǎn)上有幾個(gè)基本點(diǎn)值得考慮，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懙降鞍踪|(zhì)的后續(xù)純化。

哪種表達(dá)系統(tǒng)能提供最高的表達(dá)水平？一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)水平越高，就越容易獲得大量高純度的蛋白質(zhì)。

如果選擇大腸桿菌表達(dá)，最終目的是可溶性表達(dá)還是不溶性的包涵體的形式表達(dá)？分離包涵體本身可以構(gòu)成一個(gè)重要的純化步驟，由于重組蛋白在包涵體中的豐度較高，分離包涵體本身就是一個(gè)重要的純化步驟;這必須與從包涵體中溶解并隨后重新折疊目標(biāo)蛋白的難易程度和可溶性蛋白的最終產(chǎn)量相平衡^[5]。為了優(yōu)化包涵體的功能蛋白產(chǎn)量，人們做了大量的工作^[6]。

另一個(gè)需要考慮是是否針對(duì)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(分泌)表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)需要從大量的宿主細(xì)胞蛋白中純化該蛋白。相反，目標(biāo)蛋白的有效分泌會(huì)導(dǎo)致從少量分泌的宿主蛋白中純化出蛋白，特別是在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞^[7]。

樣品制備

無(wú)論目標(biāo)蛋白的來(lái)源是什么，作為純化起始點(diǎn)的粗樣的初始制備都是重要的，需要在考慮表達(dá)和純化策略的同時(shí)加以考慮。

目的蛋白的胞外分泌可能允許使用一種快速而直接的親和純化方案^[7]；唯一需要的樣品制備可能是將條件培養(yǎng)基從貼壁細(xì)胞中倒出或低速離心去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，可能有必要添加蛋白酶抑制劑或調(diào)整pH值為第一步色譜準(zhǔn)備，但這些都是簡(jiǎn)單的步驟。然而，如果要進(jìn)行離子交換作為第一個(gè)凈化步驟，樣品可能首先需要脫鹽。如果要處理大量的條件培養(yǎng)基，這在技術(shù)上是有挑戰(zhàn)性的;根據(jù)需要脫鹽的介質(zhì)的體積，通常采用透析或交叉流過(guò)濾。

如果靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，則首先需要通過(guò)離心分離獲得細(xì)胞，然后再將其重新懸浮在適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液中。如上所述，裂解緩沖液需要包含適當(dāng)?shù)木彌_液和其他添加劑，以確保目標(biāo)蛋白的最大穩(wěn)定性。如果研究者要避免在柱層析之前進(jìn)行耗時(shí)的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的成分也需要與隨后的純化步驟相兼容。

接下來(lái)，需要一種有效的方法來(lái)溶解細(xì)胞。文獻(xiàn)中描述了各種方法。大腸桿菌細(xì)胞可以用法國(guó)壓力裂解法（雖然這種方法不容易擴(kuò)展）、超聲波裂解法或以洗滌劑為基礎(chǔ)的裂解法（市面上有許多裂解試劑）裂解。在裂解液中加入溶菌酶可以提高洗滌劑裂解的效率。以清潔劑為基礎(chǔ)的裂解反應(yīng)非常溫和，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌DNA的顯著剪切。因此，通常需要加入DNAase制劑(高純度的制劑在市場(chǎng)上可以買到)來(lái)降低樣品的粘度，制備出具有良好流動(dòng)特性的樣品^[8]。

超聲波或洗滌劑為基礎(chǔ)的方法也可以溶解哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。如果核膜明顯溶解，可能需要DNAase處理來(lái)降低樣品粘度^[8]。

一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲(chóng)/哺乳動(dòng)物）被溶解，通常需要通過(guò)離心法去除細(xì)胞碎片（通常在4℃下15 000 x g持續(xù)15分鐘，以避免色譜柱堵塞[8]。得到的上清液是柱層析純化目標(biāo)蛋白的起點(diǎn)^[8]。

柱層析簡(jiǎn)介

柱層析設(shè)備

柱層析法的原理是將一個(gè)大的蛋白質(zhì)池分離成許多小的蛋白質(zhì)池，其中一些富含感興趣的蛋白質(zhì)。雖然柱層析設(shè)備昂貴且專業(yè)，但純化只需要基本設(shè)備。

圖4.使用蛋白質(zhì)A、G或L.A.的親和純化示意圖。抗體包含幾個(gè)感興趣的區(qū)域：對(duì)同一類的所有蛋白質(zhì)相同的Fc（片段，常數(shù)）、對(duì)每種抗體提供特異性的Fv（片段，變量）和實(shí)際接觸特異性抗原的Fab（片段，抗原結(jié)合）。b.特定種類的抗體可通過(guò)親和純化進(jìn)行非選擇性純化，其中配體（蛋白質(zhì)A、G或L）與基質(zhì)結(jié)合。蛋白A、G或L也可用于純化特定蛋白。在這種情況下，抗體將作為中間配體，為其抗原提供選擇性。

柱層析基本設(shè)備:

1.固定相：一種惰性基質(zhì)，通常帶有一個(gè)附加的官能團(tuán)以促進(jìn)蛋白質(zhì)相互作用，用于分離蛋白質(zhì)。固定相和官能團(tuán)的選擇取決于所用色譜的類型和所用的方法。

2.圓柱：一個(gè)圓柱形的玻璃容器，有不同的長(zhǎng)度和直徑供選擇?？梢再?gòu)買帶有固定相的預(yù)包裝柱，并準(zhǔn)備連接到自動(dòng)色譜系統(tǒng)（在本節(jié)第2部分中討論），也可以購(gòu)買空的手動(dòng)包裝柱。自動(dòng)流動(dòng)色譜法與重力流動(dòng)色譜法需要不同類型的色譜柱。

3.溶劑：含有添加劑的緩沖液，用于平衡、洗滌和洗脫固定相中的蛋白質(zhì)。不同類型的色譜需要不同的溶劑條件。

4.收集管：用于收集洗脫樣品的容器。自動(dòng)分餾收集器需要特殊的管；但是，任何管或容器都適合手動(dòng)分餾收集。

5.純度測(cè)定：測(cè)定樣品中特定蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)相對(duì)含量的方法。在進(jìn)行純化方案的下一步之前，必須在每一步之后測(cè)定含有感興趣蛋白質(zhì)的組分。一些分析純度的常用方法將在后面的章節(jié)中討論。

柱層析系統(tǒng)

柱層析可以用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行(圖2)，該系統(tǒng)使用泵迫使溶劑以設(shè)定的流速通過(guò)填充柱，也可以通過(guò)重力流來(lái)運(yùn)行。自動(dòng)化和重力流系統(tǒng)都可以與自動(dòng)分餾收集系統(tǒng)耦合。每個(gè)系統(tǒng)都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。GE Healthcare AKTA FPLC系統(tǒng)是非常常見(jiàn)的選擇^[9-18]。

表3 蛋白質(zhì)的色譜分離系統(tǒng)。資料來(lái)源：GE。

Type of System	Advantages	Disadvantages
Automated	Can let run by itself Often coupled to an absorbance detector Can program equilibration and wash steps Easy to set up a gradient for elution Very reproducible	Requires specific, costly equipment The maximum flow rate is dependent on the pressure limit of the column
Gravity Flow	Less expensive The user has more control Can make adjustments during run	More labor intensive The flow rate is limited by gravity

柱層析類型

四種主要的柱層析法包括親和層析法、離子交換層析法(IEX)、疏水相互作用層析法(HIC)和尺寸排阻層析法(SEC)。大多數(shù)凈化方案要求使用以上一種以上的色譜程序，以獲得下游應(yīng)用所需的純度。選擇最合適的色譜方法和這些方法的順序是優(yōu)化蛋白質(zhì)純化方案的關(guān)鍵。

表4 四種最常見(jiàn)的用于蛋白質(zhì)純化的柱層析方法。

Type of Chromatography	Separates Proteins By	Bind With	Elute With
Affinity	A specific interaction	No competing ligand	Competing ligand (specific); conditions that disrupt protein/protein interactions (non-specific)
Ion Exchange	Net surface charge	Low ionic strength	High ionic strength; Increased (cation exchange) or decreased (anion exchange) pH
Hydrophobic Interaction	Hydrophobicity	High ionic strength	Low ionic strength
Size Exclusion	Hydrodynamic radii

通過(guò)分析蛋白質(zhì)的序列，可以識(shí)別出可能有助于其純化的獨(dú)特特征。蛋白質(zhì)的大小和電荷(在特定的pH值下)可以確定，同時(shí)還可以確定大量的疏水基團(tuán)。

親和層析

親和層析依賴于蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合配體的特異性可逆結(jié)合。配體可以直接與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與共價(jià)附著在蛋白質(zhì)上的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析法通常是最有效的純化方法，通常用于純化方案的早期階段。根據(jù)下游的應(yīng)用，親和純化可能是獲得足夠純度所需的唯一層析步驟。

圖5 蛋白質(zhì)上的凈電荷受其溶劑的pH值的影響。在pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，因此不會(huì)與陽(yáng)離子交換或陰離子交換固定相結(jié)合。調(diào)節(jié)pH值，使其高于或低于pI，就會(huì)產(chǎn)生凈電荷，并使蛋白質(zhì)與陰離子交換(pH > pI)或陽(yáng)離子交換(pH < pI)固定相結(jié)合。

親和層析的固定相是由一個(gè)與配體共價(jià)連接的惰性基質(zhì)構(gòu)成的，配體特異性地與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組結(jié)合。惰性基體通常由交聯(lián)的瓊脂糖或聚丙烯酰胺組成。蛋白可通過(guò)親和層析進(jìn)行選擇性或非選擇性純化。在選擇性親和層析中，使用特定于蛋白質(zhì)或共價(jià)附著標(biāo)簽的配體。在非選擇性親和層析中，如蛋白A、G、L用于免疫球蛋白，或肝素用于DNA結(jié)合蛋白，或凝集素用于糖蛋白，配體與一組具有類似結(jié)合能力的蛋白結(jié)合。

在兩種親和層析中，蛋白質(zhì)都是在影響蛋白質(zhì)(或標(biāo)簽)與其配體結(jié)合的條件下裝載在色譜柱上的。結(jié)合蛋白在不破壞特異性相互作用的條件下被洗滌，但這種條件可以破壞污染蛋白與固定相之間的任何非特異性相互作用。然后用含有競(jìng)爭(zhēng)性分子或破壞所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的條件的緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。相互競(jìng)爭(zhēng)的分子與配體結(jié)合，取代感興趣的蛋白質(zhì)。這種競(jìng)爭(zhēng)性分子通常通過(guò)另一種色譜方法或透析從相關(guān)蛋白中去除。通過(guò)干擾所有蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用來(lái)從固定相中洗脫蛋白質(zhì)的方法包括調(diào)整緩沖液的pH值或離子強(qiáng)度。這些方法會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，建議將洗脫的蛋白質(zhì)立即中和或稀釋，以減少蛋白質(zhì)的損傷。對(duì)于一些親和層析的形式，已經(jīng)描述了替代洗脫條件，以最大限度地提高功能蛋白的產(chǎn)量^[19，20]。

表5 用于特異性和典型洗脫條件的具有官能團(tuán)（配體）的選擇性和非選擇性親和層析形式的示例?？偨Y(jié)自Thermo Fisher Pierce和GE。根據(jù)Labome對(duì)200多種出版物的調(diào)查，不同類型欄目的常見(jiàn)供應(yīng)商見(jiàn)下文。

Protein to Purify	Ligand	Elute With
Antibody (antigen-specific)	Antigenic peptide	Free peptide
Polyhistidine-tagged protein	Ni2+?or Co2+	Imidazole or free histidine
FLAG-tagged protein	FLAG-specific antibody	FLAG peptide or low pH
GST-tagged protein	Reduced glutathione	Free glutathione
Myc-tagged protein	Myc-specific antibody	Low pH
Antibody (class-specific)	Protein A , G, or L or protamine	Extremes in pH
DNA-binding protein	Heparin	High ionic strength

在設(shè)計(jì)用于蛋白表達(dá)的質(zhì)粒時(shí)，親和標(biāo)記可以插入N或c端(或在罕見(jiàn)的情況下，插入具有已知結(jié)構(gòu)的柔性蛋白環(huán)中)，以幫助純化。有關(guān)常見(jiàn)標(biāo)簽和標(biāo)簽相關(guān)討論的列表，請(qǐng)參見(jiàn)Labome關(guān)于蛋白質(zhì)/protide標(biāo)簽的調(diào)查。

抗體通常是根據(jù)抗體和抗原之間發(fā)生的高度特異性相互作用(抗體識(shí)別的序列)來(lái)純化的。含有抗原的肽可偶聯(lián)到基質(zhì)上特異性結(jié)合抗體。降低洗脫緩沖液的pH值，干擾抗體/肽相互作用，釋放結(jié)合抗體。這種方法通常用于從粗血清中分離抗體。

圖6. 離子交換色譜法。蛋白質(zhì)以低離子強(qiáng)度與帶電的固定相結(jié)合。結(jié)合蛋白可以通過(guò)增加緩沖液的離子強(qiáng)度或通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)洗脫。

蛋白質(zhì)也可以通過(guò)非選擇性的方式親和純化。在非選擇性純化中，固定相上的配體與一組具有相似結(jié)合伙伴的蛋白質(zhì)結(jié)合。非選擇性親和純化的一個(gè)例子是dna結(jié)合蛋白的純化。肝素在結(jié)構(gòu)和電荷上都與DNA相似，可作為DNA結(jié)合蛋白親和純化的配體。雖然所有的dna結(jié)合蛋白理論上都可以與這個(gè)固定相結(jié)合，但是大多數(shù)其他的蛋白在沒(méi)有結(jié)合的情況下就會(huì)通過(guò)，從而使我們感興趣的蛋白質(zhì)得到充分的富集。另一個(gè)例子是通過(guò)將其恒定(Fc)區(qū)域與配體、蛋白A、G或l結(jié)合來(lái)富集抗體。GE Healthcare蛋白A親和柱是常見(jiàn)的選擇^[21-23]，蛋白G也是如此^[24]。對(duì)于IgM，魚(yú)精蛋白親和層析可以使用^[25]。

使用類似的結(jié)合模式(抗體與蛋白A、G或L配體結(jié)合)，抗體的抗原結(jié)合(Fab)區(qū)域仍可與特定抗原結(jié)合。因此，可以根據(jù)偶聯(lián)的配體/抗體和抗體/抗原之間的特異性相互作用來(lái)純化特定的蛋白質(zhì)。

常見(jiàn)問(wèn)題及排除方法見(jiàn)表6。

表6. 親和層析故障排除。來(lái)自：GE。

Problem	Cause	Solution
Protein does not bind	Tag was not translated or is not accessible	Check plasmid sequence or move the tag to a different location
	Binding conditions are not appropriate	Adjust buffer conditions
	Not enough time was allowed for binding	Decrease flow rate or stop column to allow incubation
Protein does not elute	Affinity between ligand and tag is very high	Increase concentration of competitor (specific) or stringency of conditions (non-specific)
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
Low resolution	Flow rate is either too fast or too slow	Adjust flow rate
	The column was not washed sufficiently	Wash with higher stringency buffer; Clean stationary phase according to manufacturer
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
	Elution conditions are not stringent enough	Increase concentration of competitor (specific) or adjust conditions (non-specific)
Protein loses activity during procedure	Protein is unfolded or aggregated	Adjust buffer conditions for more protein stability
	A cofactor required for activity was removed during purification	Add cofactor

離子交換色譜法

離子交換色譜(IEX)通過(guò)蛋白質(zhì)和帶電固定相之間的靜電相互作用，根據(jù)蛋白質(zhì)的凈表面電荷來(lái)分離蛋白質(zhì)。IEX存在兩種類型：(1)陰離子交換(與負(fù)電荷蛋白結(jié)合的帶正電荷的固定相)；(2)陽(yáng)離子交換(與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合的帶負(fù)電荷的固定相)。離子交換層析是蛋白質(zhì)純化方案中常用的中間步驟，但在純化過(guò)程中較早或較晚使用時(shí)，可對(duì)某些蛋白質(zhì)產(chǎn)生較高的分辨力。

所有的蛋白質(zhì)都表現(xiàn)出一種凈電荷，這種凈電荷依賴于蛋白質(zhì)的氨基酸組成和任何共價(jià)連接的修飾。當(dāng)溶劑與蛋白質(zhì)交換氫離子時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷受溶解于其中的溶劑的pH值的影響。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)是蛋白質(zhì)不帶凈電荷時(shí)的pH值。當(dāng)pH值高于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，而pH值低于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。因此，可以調(diào)整溶劑的pH值以促進(jìn)與IEX的結(jié)合或促進(jìn)結(jié)合蛋白的洗脫。

圖7 ?疏水作用色譜法。在高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)部分脫溶，導(dǎo)致它們采用交替構(gòu)象，其中通常埋藏的疏水性殘基暴露得更多。這些殘基可以與共軛于基質(zhì)的疏水官能團(tuán)形成疏水相互作用。降低離子強(qiáng)度會(huì)使蛋白質(zhì)重新形成其固有的構(gòu)象，從而掩蓋其疏水性殘基。這減少了蛋白質(zhì)和固定相之間的疏水相互作用，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的洗脫。

理論上，如果相應(yīng)地調(diào)節(jié)緩沖液的pH，則所有蛋白質(zhì)均可與陽(yáng)離子交換和陰離子交換結(jié)合。然而，對(duì)于蛋白質(zhì)純化而言，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是選擇純化條件的最重要考慮因素，因此，蛋白質(zhì)結(jié)合柱是最合適的。因此，有必要確定結(jié)合任何形式的離子交換層析所需的條件是否影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能。典型地，結(jié)合一種類型的離子交換的條件比另一種類型更適合特定的蛋白質(zhì)。

了解蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)可以幫助確定最合適的離子交換色譜類型。在線工具可用于計(jì)算蛋白質(zhì)的理論P(yáng)I。這些計(jì)算完全基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，不考慮蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。在其固有狀態(tài)下，蛋白質(zhì)的某些殘基比另一些蛋白質(zhì)更容易暴露，因此，實(shí)際的PI和凈表面電荷有時(shí)與理論上確定的不同^[26]。氨基酸的相對(duì)分布也會(huì)影響蛋白質(zhì)的PI[^27]，在理論P(yáng)I計(jì)算中沒(méi)有考慮到這一點(diǎn)。有些技術(shù)允許實(shí)驗(yàn)測(cè)定蛋白質(zhì)的自然狀態(tài)下的PI，包括電泳等電聚焦^[28]，毛細(xì)管等電聚焦^[29]，以及最近的一種基于高通量發(fā)光的方法^[30]。

通常，蛋白質(zhì)與IEX的結(jié)合必須通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定，使用具有一定pH值范圍的溶劑，以確定蛋白質(zhì)保留的最佳pH值。與pI相距約一個(gè)pH單位的溶劑通常足以與蛋白質(zhì)結(jié)合^[31]；然而，在某些情況下，需要與pI相距更遠(yuǎn)的pH值^[32]。

IEX的固定相由具有共價(jià)鍵的惰性瓊脂糖基或聚合物基質(zhì)組成?；|(zhì)顆粒有多種尺寸，既可以是非多孔的，也可以是含有可變尺寸的孔隙?；|(zhì)的選擇取決于所需的結(jié)合容量、分辨率和流量。較小的顆粒尺寸提供更高的分辨率，但需要較低的流速和運(yùn)行時(shí)間。多孔基質(zhì)比非多孔基質(zhì)具有更高的結(jié)合能力.在非多孔基質(zhì)中，蛋白質(zhì)不能進(jìn)入樹(shù)脂，因此，比多孔基質(zhì)提供更高的樣品回收率、更高的分辨率和更短的運(yùn)行時(shí)間。一項(xiàng)研究表明，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，當(dāng)被多孔基質(zhì)和非多孔基質(zhì)分離時(shí)，分辨率和恢復(fù)是相似的；然而，對(duì)于較大的蛋白質(zhì)，多孔基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致基于尺寸排除效應(yīng)的分辨率下降^[33]。

圖8.以鹽（硫酸銨）梯度遞減的疏水作用柱洗脫的蛋白質(zhì)。對(duì)所研究蛋白質(zhì)的總蛋白含量和活性進(jìn)行了分析。從蛋白質(zhì)活性可以看出，以45分為中心的峰值包含了我們感興趣的蛋白質(zhì)。從http://www.insectscience.org/9.04/。

IEX中最常用的四個(gè)荷電官能團(tuán)如下圖所示。它們分為強(qiáng)交換器和弱交換器，強(qiáng)交換器比弱交換器的pH值范圍更大（圖8）。

陰離子交換(正電荷固定相):

1.季銨(Q)強(qiáng)陰離子交換器

2.二乙基氨基乙(DEAE) -弱陰離子交換器

陽(yáng)離子交換(負(fù)電荷固定相):

1.甲基磺酸鹽(S) -強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑

2.羧甲基(CM) -弱陽(yáng)離子交換器

當(dāng)結(jié)合所需的pH值是非常酸性或堿性時(shí)（假設(shè)該pH值也適合于保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性），應(yīng)使用強(qiáng)交換劑，因?yàn)楣倌軋F(tuán)在較大的ph范圍內(nèi)保持電荷^[34]。研究表明，弱交換劑能夠減少某些蛋白質(zhì)的保留，使其在較低離子強(qiáng)度下洗脫^[35]。由于高離子強(qiáng)度會(huì)影響某些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性^[36]，弱交換劑可能更適合于不需要極端pH值來(lái)結(jié)合的蛋白質(zhì)。

在離子交換色譜中，固定相首先用低離子強(qiáng)度緩沖液平衡。然后將蛋白樣品裝入用于平衡的相同的低離子強(qiáng)度緩沖液中的固定相。結(jié)合蛋白在用高離子強(qiáng)度緩沖液或在某些情況下用pH值改變的緩沖液洗脫前要進(jìn)行大量清洗(圖6)。洗脫緩沖液中的反離子與帶電的固定相相互作用，取代結(jié)合蛋白。某些鹽類在離子交換色譜中比其他鹽類更有效，因?yàn)樗鼈兛梢匀〈Y(jié)合蛋白并對(duì)蛋白穩(wěn)定性^[37]產(chǎn)生影響。通常用NaCl或KCl洗脫，Na+或K+作為陽(yáng)離子交換層析的對(duì)位離子，Cl-作為陰離子交換層析的對(duì)位離子。或者，可以改變緩沖液的pH值，以減少蛋白質(zhì)的電荷并破壞其與固定相的相互作用。對(duì)于與陽(yáng)離子交換固定相結(jié)合的蛋白質(zhì)，增加緩沖液的pH值會(huì)使蛋白質(zhì)上的正電荷減少，從而從柱中洗脫出來(lái)。對(duì)于結(jié)合在陰離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，降低緩沖液的pH值會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)上的負(fù)電荷減少，從而從色譜柱中洗脫出來(lái)。

或者，可以調(diào)節(jié)緩沖液的pH，使得所關(guān)注的蛋白質(zhì)不與離子交換固定相結(jié)合，同時(shí)污染蛋白質(zhì)。在這種情況下，感興趣的蛋白質(zhì)被收集在流通相中，而一些污染的蛋白質(zhì)通過(guò)它們與固定相的結(jié)合而被去除。

與其他色譜方法一樣，離子交換色譜可能需要一些故障排除，以確定蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)洗脫和足夠分辨率的最佳條件。

表7.離子交換色譜故障排除,來(lái)自：GE.

Problem	Cause	Solution
Protein does not bind	Column was not equilibrated	Run more equilibration buffer through the column and reload protein
	The ionic strength of binding buffer is too high	Lower ionic strength of the buffer
	pH is not far enough from pI	Adjust buffer pH (lower for cation exchange, higher for anion exchange)
Protein does not elute	Ionic strength of elution buffer is too low	Increase ionic strength
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
Low resolution	Flow rate is either too fast or too slow	Adjust flow rate
	The column was not washed sufficiently	Wash with a higher ionic strength buffer; Clean stationary phase according to manufacturer
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
Protein loses activity during procedure	Protein is unfolded or aggregated	Adjust buffer conditions for more protein stability
	A cofactor required for activity was removed during purification	Add cofactor

疏水相互作用色譜法

疏水相互作用層析(HIC)基于它們的疏水性分離蛋白質(zhì)，并且通常用作純化方案中的中間步驟。蛋白質(zhì)結(jié)合在高離子強(qiáng)度緩沖液中的固定相，因此，HIC通?？梢栽陔x子交換層析之后立即進(jìn)行，不需要緩沖液交換或稀釋。HIC也通常在氨硫酸鹽沉淀之后進(jìn)行，該過(guò)程可用于通過(guò)快速而不是全部的蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)來(lái)除去蛋白質(zhì)。HIC有時(shí)可應(yīng)用于純化方案的早期步驟或作為從感興趣的蛋白質(zhì)中除去痕量雜質(zhì)的最后步驟。

溶液中鹽離子的存在會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分展開(kāi)和通常埋藏的疏水殘基的暴露。與固定相結(jié)合的蛋白質(zhì)采用其天然構(gòu)象作為緩沖液，離子強(qiáng)度較低。這減少了與固定相相互作用的疏水殘基的暴露，有助于從柱中洗脫。對(duì)于通過(guò)降低離子強(qiáng)度而自發(fā)復(fù)性的蛋白質(zhì)，HIC是一種有價(jià)值的色譜純化方法。

通常情況下，緩沖液的離子強(qiáng)度應(yīng)盡可能低，以結(jié)合相關(guān)蛋白，同時(shí)防止其沉淀。如果蛋白結(jié)合所需的離子強(qiáng)度高，導(dǎo)致相關(guān)蛋白沉淀，可以使用較低的離子強(qiáng)度。在這種情況下，色譜程序可以用來(lái)分離所有的結(jié)合蛋白，從蛋白的興趣流動(dòng)沒(méi)有結(jié)合。

在將樣品裝入柱之前，固定相必須與高離子強(qiáng)度緩沖液(與蛋白質(zhì)樣品所用的緩沖液相同)平衡。然后將樣品裝入柱中，對(duì)柱進(jìn)行大量清洗，并用低離子強(qiáng)度緩沖液洗脫蛋白質(zhì)(圖7和圖8)。

疏水作用色譜中使用的固定相由交聯(lián)瓊脂糖或合成共聚物的基質(zhì)組成。然后，烷基或芳基配體與堿基質(zhì)結(jié)合，為疏水分子提供特異性分離。

官能團(tuán)類型:

1. 烷基:不同長(zhǎng)度的烴鏈；通常采用丁基或辛基。隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加，固定相的結(jié)合能力增加^[38]。官能團(tuán)結(jié)合完全基于蛋白質(zhì)的疏水性
2. 芳基-由芳香環(huán)衍生出的官能團(tuán)；通常是苯基。芳基基團(tuán)提供了更多的特異性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)也可以通過(guò)堿基堆積與官能團(tuán)相互作用。

用于結(jié)合和洗脫的鹽的類型和濃度必須根據(jù)每種蛋白質(zhì)經(jīng)驗(yàn)確定。此外，必須在洗脫后確保蛋白質(zhì)的重折疊和功能。

與其他形式的柱層析一樣，最優(yōu)的HIC程序可能需要大量的故障排除。每種蛋白質(zhì)都需要調(diào)整緩沖條件和固定相，以確保最佳分離。

表8 疏水相互作用色譜法的故障排除，來(lái)源：GE

Problem	Cause	Solution
Protein does not bind	Column was not equilibrated	Run more equilibration buffer through the column and reload protein
	The ionic strength of binding buffer is too low	Increase ionic strength of the buffer
	Protein aggregated at the ionic strength used	Decrease ionic strength of buffer or try a different salt
Protein does not elute	Ionic strength of elution buffer is too high	Decrease ionic strength
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
	Retention is too high	Try a different stationary phase that offers less retention
Low resolution	Flow rate is either too fast or too slow	Adjust flow rate
	Column was not washed sufficiently	Wash with a lower ionic strength buffer; Clean stationary phase according to manufacturer
	Protein aggregated on column	Adjust buffer conditions for more protein stability
	Poor retention on column	Try a different stationary phase that offers greater retention
Protein loses activity during procedure	Protein is unfolded or aggregated	Adjust buffer conditions for more protein stability
	Protein did not return to its native conformation	Try binding with a different salt or at a lower ionic strength; Include additives for protein stability
	A cofactor required for activity was removed during purification	Add cofactor

尺寸排阻層析（SEC）

尺寸排阻層析（Size exclusion chromatography,SEC）根據(jù)蛋白質(zhì)的流體動(dòng)力學(xué)半徑分離蛋白質(zhì)，這種性質(zhì)由分子的大小和形狀決定。與前面描述的其他層析法不同，蛋白質(zhì)在SEC中不與固定相結(jié)合。相反，蛋白質(zhì)是通過(guò)它們?cè)诙栊怨潭ㄏ嘀械膶?dǎo)航速度來(lái)分離的(圖9)。

圖9?三種不同流體力學(xué)半徑的蛋白質(zhì)的混合物被加載到一個(gè)層析柱上。大的蛋白質(zhì)首先脫溶，因?yàn)樗鼈儾荒苓M(jìn)入基質(zhì)的孔隙，并有一個(gè)直接的途徑通過(guò)柱。更小的蛋白質(zhì)可以進(jìn)入孔隙，有一個(gè)更復(fù)雜的路徑，因此，需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)穿過(guò)基質(zhì)和從柱中洗脫

Superdex通常是典型SEC程序的最佳選擇，因?yàn)樗c大多數(shù)溶劑兼容，并提供所有可用的固定相的最高分辨率。

與其他色譜方法一樣，SEC也有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，是否決定使用這種方法取決于蛋白質(zhì)及其下游的應(yīng)用。

SEC的優(yōu)點(diǎn)：

1. 提供緩沖交換和脫鹽。
2. 使其他凈化技術(shù)可能無(wú)法分離的相似物種(例如截?cái)嗪凸丫垠w)分離。
3. 與多種溶劑相容。

4.保留和洗脫不依賴于任何特定的蛋白質(zhì)性質(zhì)。

SEC的缺點(diǎn)：

1. 性能對(duì)柱填料非常敏感。
2. 蛋白質(zhì)與樹(shù)脂之間存在非特異性的相互作用，從而降低了分辨率。
3. 復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物分辨率低。
4. 樣品必須以小體積裝載，以獲得足夠的分辨率。對(duì)于高濃度沉淀的蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，這可能是個(gè)問(wèn)題。

優(yōu)化SEC條件以獲得最大的分辨率通常是耗時(shí)的，但某些因素會(huì)對(duì)分辨率產(chǎn)生巨大的影響。

SEC提高蛋白質(zhì)分辨率的方法：

1.盡量減少樣本量。體積越小，洗脫部分的擴(kuò)散越小。

2.在緩沖液中加鹽。少量的鹽將有助于防止蛋白質(zhì)和固定相之間的非特異性相互作用。這將使所有的蛋白質(zhì)分子在色譜柱的長(zhǎng)度上保持一致。

3.使用中等流速。過(guò)快地運(yùn)行色譜柱不會(huì)讓小分子有時(shí)間進(jìn)入基質(zhì)孔隙，而流速過(guò)慢則會(huì)讓樣品擴(kuò)散有更多的時(shí)間。

4.確保樣品和溶劑粘度相似。調(diào)整采樣條件以近似匹配緩沖器。

5.調(diào)整柱長(zhǎng)。太短的色譜柱不能進(jìn)行足夠的蛋白質(zhì)分離?；蛘撸L(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)樣品擴(kuò)散。

6.重新包裝柱子。柱填料對(duì)蛋白質(zhì)的分離有很大的影響。

如果顆粒沒(méi)有很好地分散，或者如果氣泡被困在色譜柱中，分子無(wú)法正確地通過(guò)固定相。此外，如果允許層析柱干運(yùn)行，必須重新填料。無(wú)法解釋的低分辨率，通常要?dú)w咎于填料不良。

由于SEC不能根據(jù)與官能團(tuán)的相互作用來(lái)分離蛋白質(zhì)，所以所有的蛋白質(zhì)都是在相同的條件下洗脫的，因此，只能對(duì)水動(dòng)力半徑非常不同的蛋白質(zhì)獲得分辨率。因此，在純化方案的初始階段，當(dāng)有許多污染蛋白質(zhì)時(shí)，SEC不是一個(gè)合適的色譜方法。然而，SEC確實(shí)提供了一種快速、可靠的方法，用于在凈化的早期或中期階段去除樣品中的鹽或小分子。在純化的最后階段，當(dāng)僅存在微量污染物時(shí)，SEC是一種有價(jià)值的蛋白質(zhì)分離和交換的方法。

蛋白質(zhì)的洗脫與分析

蛋白質(zhì)洗脫方法

與固定相結(jié)合的蛋白質(zhì)用破壞結(jié)合相互作用的溶劑條件洗脫。這些洗脫條件因?qū)游鲱愋秃透信d趣蛋白質(zhì)的性質(zhì)而異。蛋白質(zhì)洗脫有三種常用方法：分批洗脫、分步洗脫和線性梯度洗脫。最佳方法的選擇取決于所執(zhí)行的層析類型和所需的分辨率。

1. 分批洗脫法-單個(gè)洗脫條件在一個(gè)步驟中置換所有結(jié)合蛋白。這種機(jī)制最適用于基于非常特殊相互作用（即親和層析）的層析過(guò)程。分批洗脫不提供任何分辨率，但它是快速去除污染物的理想方法。這需要預(yù)先了解置換感興趣蛋白質(zhì)所需的緩沖條件。
2. 分步洗脫--連續(xù)進(jìn)行多步洗脫，每一步都有更嚴(yán)格的條件。在逐步洗脫中，所收集的組分?jǐn)?shù)取決于洗脫條件的個(gè)數(shù)。分步洗脫比分批洗脫具有更好的分辨率，但比線性梯度洗脫的分辨率低。
3. 線性梯度洗脫-收集多個(gè)連續(xù)的組分，同時(shí)線性調(diào)整洗脫條件。線性梯度為離子交換層析和疏水相互作用層析提供了最高的分辨率。通常，會(huì)收集大量連續(xù)的組分。

尺寸排阻色譜法不需要這些洗脫方法，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和固定相之間沒(méi)有相互作用。蛋白質(zhì)被裝載到色譜柱上，在整個(gè)過(guò)程中不改變緩沖條件的情況下，收集大量組分，直到所有蛋白質(zhì)被洗脫。

理想情況下，層析柱的洗脫緩沖液與后續(xù)層析柱相容，無(wú)需在純化步驟之間進(jìn)行緩沖液交換或透析。

較不常用的層析法

羥基磷灰石(羥基化磷酸鈣)層析法是一種蛋白質(zhì)純化技術(shù)，最初描述于20世紀(jì)50年代中期^[42]。球形羥基磷灰石的商業(yè)化應(yīng)用使羥基磷灰石柱層析技術(shù)成為一種可行的技術(shù)^[43]。蛋白質(zhì)與羥基磷灰石柱相互作用的機(jī)理是復(fù)雜的。蛋白質(zhì)最常被磷酸鹽梯度洗脫。(討論情況見(jiàn)^[43])。羥基磷灰石與其他色譜技術(shù)具有不同的選擇性，可以為純化難純化的蛋白質(zhì)或作為最終的拋光步驟提供有用的補(bǔ)充。羥基磷灰石層析已成功地用于治療級(jí)抗體的純化^[44]。

色譜聚焦法是一種基于蛋白質(zhì)pI的柱色譜分離方法。蛋白質(zhì)與專門的離子交換介質(zhì)結(jié)合，用pH梯度洗脫。染色質(zhì)聚焦的選擇性不同于其他技術(shù)，因此作為最后的“拋光”步驟是有用的^[45]。

純度分析

在每次色譜分離后，必須對(duì)各組分進(jìn)行分析，以確定含有感興趣蛋白質(zhì)的組分以及各組分的相對(duì)純度。在每一步之后，這一分析都是必要的，以決定哪些部分應(yīng)該合并以供以后使用。為了確定純度，需要一種能夠測(cè)量特定蛋白質(zhì)的量相對(duì)于總蛋白質(zhì)量的分析方法。以下分析通常用于純度分析：

1. 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法 -一種根據(jù)大小來(lái)分離蛋白質(zhì)的變性凝膠。商業(yè)上可用的著色劑可以對(duì)樣品中的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化表示，從而對(duì)蛋白質(zhì)純度進(jìn)行定性評(píng)估(圖10)。SDS-PAGE對(duì)于餾分的不是理想的高通量分析方法，可能需要幾個(gè)小時(shí)；然而，它是最常用的，因?yàn)樗菀?，便宜，適合任何蛋白質(zhì)。

圖10 蛋白質(zhì)純化過(guò)程中所收集樣品的SDS-PAGE。凝膠被染色以顯示所有蛋白質(zhì)。來(lái)源：http://www.omicsonline.org/。

2. 光譜法-分析蛋白質(zhì)光學(xué)性質(zhì)的方法。這種分析蛋白質(zhì)純度的技術(shù)只適用于具有獨(dú)特光譜特征的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素P450s。這個(gè)家族的蛋白質(zhì)吸收的光的波長(zhǎng)是其他蛋白質(zhì)吸收不到的(大約是420納米^[46])，所以將420納米的吸收度與280納米(所有蛋白質(zhì)吸收的波長(zhǎng))進(jìn)行比較，可以提供蛋白質(zhì)純度的定量測(cè)量。該方法快速、高效，但僅適用于部分蛋白質(zhì)。

3. 蛋白質(zhì)活性分析法-取決于感興趣的蛋白質(zhì)的酶促測(cè)試。這種評(píng)估蛋白質(zhì)純度的方法通常與另一種形式的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定相結(jié)合，以計(jì)算相對(duì)于總蛋白質(zhì)濃度的活性。活性分析僅適用于具有易于以高通量形式監(jiān)測(cè)的活性的蛋白質(zhì)，例如蛋白酶。對(duì)于某些蛋白質(zhì)，活性測(cè)定為蛋白質(zhì)的檢測(cè)提供了一種快速、可靠的方法。活性測(cè)量通常是酶蛋白檢測(cè)的理想選擇，因?yàn)槭セ钚缘牡鞍踪|(zhì)可以被排除在隨后的使用之外。

純化蛋白的存儲(chǔ)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被認(rèn)為足夠純凈可以用于實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，它們應(yīng)該被適當(dāng)?shù)貎?chǔ)存起來(lái)。最終存儲(chǔ)緩沖液的選擇與純化過(guò)程中使用的緩沖液的選擇同樣重要，應(yīng)取決于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和純化后下游應(yīng)用所需的條件。通常，在純化方案中最后一步是選擇尺寸排阻層析，因?yàn)榇鎯?chǔ)緩沖液可以在這個(gè)層析步驟中有效交換緩沖液。純餾分可匯集起來(lái)立即儲(chǔ)存?；蛘?，最后的混合餾分可以在存儲(chǔ)之前透析到選擇的緩沖液中。

蛋白質(zhì)的貯藏條件取決于目標(biāo)蛋白質(zhì)，因此應(yīng)該對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)蛋白質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間的貯藏過(guò)程中保持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。為了提高蛋白質(zhì)在貯藏條件下的使用壽命，常常在貯藏緩沖液中添加添加劑，由于每種蛋白質(zhì)的特性不同，因此常常需要反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定最佳的貯藏條件。

高通量蛋白質(zhì)純化

在這個(gè)后基因組時(shí)代，蛋白質(zhì)的高通量純化無(wú)論是用于結(jié)構(gòu)測(cè)定還是用于藥物發(fā)現(xiàn)/化合物篩選，都引起了人們的極大興趣。為了篩選廣泛的并為所需的最終用途選擇的最佳結(jié)構(gòu)，研究人員利用了一系列商用自動(dòng)化/機(jī)器人系統(tǒng)，能夠快速、平行、半自動(dòng)化地純化親和標(biāo)記蛋白[47，48]。蛋白質(zhì)的常規(guī)純化方法仍然適用；液體處理機(jī)器人/自動(dòng)化平臺(tái)僅用于簡(jiǎn)化和加速純化過(guò)程。

膜蛋白

細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)約20-30%為膜蛋白，50%左右的小分子藥物作用于膜蛋白^[49]。因此，人們對(duì)解決膜蛋白的結(jié)構(gòu)有很大的興趣。完整膜蛋白純化的一個(gè)關(guān)鍵步驟是在保持其功能完整性的同時(shí)從脂質(zhì)雙分子層中溶解。典型的方法是先離心分離胞內(nèi)膜，然后用去垢劑溶解整體膜蛋白，再用高速離心去除不溶性膜殘基^[50-52]。大量的洗滌劑被用于膜蛋白增溶^[53-55]，在沒(méi)有任何文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室先例的情況下，研究者需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定其特定蛋白的最佳洗滌劑。所述可溶膜蛋白可通過(guò)柱層析進(jìn)行純化，其方法與可溶性蛋白基本相同。然而，純化緩沖液需要含有洗滌劑，以保持蛋白質(zhì)在可溶性狀態(tài)^[56,57]。膜蛋白的純化通常是極具挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樵趶闹|(zhì)雙層膜上初始去除并通過(guò)各種純化步驟后，蛋白質(zhì)功能完整性和聚集性會(huì)喪失。盡管如此，有幾個(gè)小組已經(jīng)成功地純化了足夠數(shù)量的膜蛋白用于結(jié)構(gòu)測(cè)定(參見(jiàn)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)聯(lián)盟)。最近，納米圓盤已經(jīng)成功地用于B家族GPCR的親和純化(參見(jiàn)Labome關(guān)于納米圓盤的文章)。

Labome綜述了有關(guān)蛋白質(zhì)純化的文獻(xiàn)

Labome調(diào)查了引用蛋白質(zhì)純化方法的出版物。表10列出了主要供應(yīng)商和凈化方法。親和力和大小排除方法是文獻(xiàn)中最常用的方法。GE Healthcare是所有方法的主要供應(yīng)商，而Qiagen是基于HIS標(biāo)簽的標(biāo)簽供應(yīng)商，和基于FLAG標(biāo)簽的重要供應(yīng)商MilliporeSigma。

表10 蛋白質(zhì)純化技術(shù)引用調(diào)查統(tǒng)計(jì)。（num：發(fā)布的數(shù)量）

純化類型?	供應(yīng)商	主要品牌	num	參考文獻(xiàn)
Affinity（親和純化）
HIS	Qiagen	Ni-NTA agarose/resin	61	[59, 60]
	GE Healthcare	Ni Sepharose, HisTrap FF/HP	35	[60, 61]
	Clontech	TALON metal affinity	22	[62, 63]
	Thermo Fisher / Invitrogen	HisPur Cobalt/Ni-NTA resin	8	[64, 65]
GST	GE Healthcare	glutathione Sepharose 4B	64	[63, 66]
	MilliporeSigma	glutathione agarose	3	[67, 68]
FLAG	MilliporeSigma	FLAG M2 affinity	17	[64, 69]
DNA binding protein	GE Healthcare	heparin	15	[70, 71]
maltose-binding protein	New England Biolabs	amylose resin	8	[71, 72]
Other cited affinity-based protein purification systems include Vector Laboratories agarose-bound Jacalin for 0-linked glycoproteins [73], strepbiotin-based systems from Thermo Fisher Pierce [74, 75], from MilliporeSigma [76], from Qiagen [77], from IBA [78], and from MilliporeSigma [74], MilliporeSigma Myc immunoaffinity resin [79], GE Healthcare poly(A)-Sepharose 4B [14], Thermo Scientific SulfoLink resin [80], BioRad Affi-Gel 10 resin [80], RepliGen protein A agarose [80] Bio-Rad Affigel [80, 81].
size exclusion（尺寸排阻層析法）
	GE-Healthcare	Superdex / Superose / Sephacryl	96	[59, 82]
ion exchange（離子交換層析）
anion	GE Healthcare	Mono Q column	10	[59, 64]
	GE Healthcare	HiTrap Q	6	[83, 84]
	GE Healthcare	Source 15Q	3	[59, 67]
	GE Healthcare	Q-Sepharose	1	[85]
	Whatman	DE52 anion exchange resin	1	[86]
	MilliporeSigma	DE52 anion exchange column	1	[61]
cation	GE Healthcare	Mono S column	6	[15, 87]
	TOROH	TSKgelSP-5PW column	1	[59]
	GE Healthcare	Source 15S	1	[59]
hydrophobic interaction（疏水作用層析法）
	GE healthcare	phenyl sepharose CL-4B	1	[88]
	MilliporeSigma	phenyl sepharose	1	[85]

在調(diào)查的文獻(xiàn)中，通過(guò)millipoma BugBuster^{[89, 90]}或AVESTIN flex C-3 cell disruptor^{[91, 92]}制備蛋白樣品，通過(guò)millipoma Amicon Ultra concentrators^{[60, 93]}、Thermo Fisher Sartorius spin columns^[94]或Vivaspin concentrators^{[70, 95, 96]}進(jìn)行濃縮。Maini Rekdal V等人通過(guò)Avestin emulsiflex C3 細(xì)胞干擾素、Thermo Fisher Scientific HisPur Ni-NTA樹(shù)脂和VMR自旋柱(目錄號(hào)97027-9)從大腸桿菌BL21(DE3)中純化了E. faecalis MMH594酪氨酸脫羧酶^[65]。

 

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