樣本收集是代謝組學(xué)研究的第一步，是保障代謝組學(xué)研究結(jié)果可靠性的最重要的環(huán)節(jié)之一。根據(jù)不同的研究目的該選取何種生物樣本？不同種類的生物樣本的規(guī)范收集流程是什么？有哪些注意事項(xiàng)（抗凝劑、凍融、抑菌劑等使用細(xì)節(jié)）？如何保存生物樣本？可保存多久等等？這些都是代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)中小伙伴經(jīng)常咨詢的問(wèn)題，本文將針對(duì)以上常見(jiàn)問(wèn)題作出系列總結(jié)歸納。

 

一.選擇什么生物樣本類型開(kāi)展臨床代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)？

代謝組學(xué)研究文獻(xiàn)中已報(bào)道的樣本類型種類繁多，如血（血清、血漿、全血）、尿、組織、糞便、細(xì)胞、腦脊液、淋巴液、唾液、羊水和膽汁等等[1]。選擇何種類型的樣本開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，取決于課題的研究目的和檢測(cè)目標(biāo)。無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)方式可采集的樣本如血、唾液、尿、糞便等生物樣品廣泛用于臨床診斷的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，這種方式采樣便于臨床轉(zhuǎn)化和推廣。組織和細(xì)胞樣品常常用于探索和解釋疾病的病理機(jī)制研究。

在臨床上，通過(guò)手術(shù)相對(duì)易于獲得癌組織且樣品量可以保障，但是，初診患者一般是通過(guò)穿刺來(lái)確診，其組織樣本量極少，而且很多疾病的診斷過(guò)程無(wú)法獲得組織樣品，因此，一般而言我們可先采用患者的血液或尿液進(jìn)行探索研究，再?gòu)膭?dòng)物和細(xì)胞水平加以驗(yàn)證。體外細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)是我們可干預(yù)細(xì)胞的生存環(huán)境或遺傳因子（基因、蛋白），常用于后期的生物學(xué)驗(yàn)證。

另外，根據(jù)不同的檢測(cè)目標(biāo)選取不同類型的生物樣本。比如檢測(cè)菌群相關(guān)代謝物，優(yōu)先選擇糞便或腸道內(nèi)容物樣本、口腔粘膜等樣品。

 

二.選用血清還是血漿？

血清和血漿樣本都被廣泛用于代謝組學(xué)研究，整體而言，血清和血漿的代謝物種類差異不大，但是多數(shù)代謝物在兩種樣本中濃度差異較大。如下圖1所示，無(wú)論是液質(zhì)平臺(tái)（正負(fù)離子檢測(cè)模式，圖1-A,B），還是氣質(zhì)平臺(tái)（下圖1-C,D），血清和血漿樣本在PCA等模型得分圖上都有明顯區(qū)分[2, 3]。相比于血漿，血清中溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、氨基酸和葡萄糖等代謝物顯著升高，而丙酮酸、檸檬酸、尿酸和磷脂酰肌醇則顯著降低[4]。因此，對(duì)于同一個(gè)研究項(xiàng)目而言，我們選擇同一類型的血液樣本（血清或血漿）。另外，從圖1-D可發(fā)現(xiàn)，血清和血漿的代謝輪廓會(huì)隨著孵化時(shí)間的不同而改變。這提示我們要確保樣本收集過(guò)程的一致性。由于血清樣本需要時(shí)間去凝結(jié)，尤其要注意盡可能保證所有樣品凝血時(shí)間的一致性。

圖1. 血清和血漿樣品PCA（A,B,C）和PLS-DA（D）得分圖。

代謝組學(xué)關(guān)注的是不同個(gè)體間代謝輪廓的差異性。那么，血清和血漿本身的差異是否會(huì)影響個(gè)體間的代謝輪廓？下圖是將血清和血漿分別作PCA得分疊加圖，從圖上可以看出個(gè)體間的相對(duì)位置較為類似。對(duì)血清和血漿樣本得分值作Mantel test，ESI+和ESI-模式下的相關(guān)性分別為0.72和0.88[2]。因此，血清和血漿樣本均可應(yīng)用于代謝組學(xué)研究，只是找出的差異生物標(biāo)志物會(huì)有細(xì)微的區(qū)別。

 

圖2. 血清和血漿樣品分別作PCA后的疊加得分圖。

 

三.如何選擇血漿抗凝？

血漿是血液經(jīng)抗凝、離心除去血細(xì)胞后得到的淡黃色液體。常用的抗凝劑有檸檬酸、EDTA和肝素鹽等。其中，檸檬酸和EDTA是通過(guò)鈣離子鰲合作用而抗凝，而肝素是通過(guò)激活抗凝血酶，抑制凝血因子而抗凝。代謝組學(xué)項(xiàng)目一般不建議選擇檸檬酸作為抗凝劑，因?yàn)闄幟仕崾菣C(jī)體內(nèi)重要代謝通路——三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。而EDTA在NMR上會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的噪音信號(hào)[5]。那肝素鹽是否就是最佳的抗凝劑選擇？有多篇報(bào)道表明肝素鹽抗凝管會(huì)在液質(zhì)上產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾信號(hào)[2, 6]，如下圖3所示,經(jīng)鑒定，這些干擾是聚乙烯醇的信號(hào)，可能來(lái)自于抗凝管中的塑料。因此，若選擇質(zhì)譜作為代謝組學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，我們推薦EDTA作為血漿抗凝劑。

 

圖3. 肝素鋰抗凝血漿的液質(zhì)色譜圖。

 

四.尿液收集是否需要加抑菌劑？

尿樣收集具有無(wú)創(chuàng)和易于獲得的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。由于尿液中細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，有些研究會(huì)在尿液中添加如硼酸和疊氮化鈉等抑菌劑保護(hù)尿液樣本不被污染。但這些外來(lái)化學(xué)試劑的添加不可避免地會(huì)對(duì)尿液中的代謝物產(chǎn)生不利影響[7]。抑菌劑并不能完全去除掉細(xì)菌，選擇離心加微孔濾膜過(guò)濾的方式更佳[8]。另外，尿液樣品在低于-25℃條件下儲(chǔ)存時(shí)，添加抑菌劑和不加抑菌劑，樣品的代謝輪廓沒(méi)有差異[9]。因此，我們不建議在尿液樣品中添加如疊氮化鈉等抑菌劑。

 

五.存儲(chǔ)條件對(duì)代謝物是否有影響？

樣品長(zhǎng)期存儲(chǔ)于液氮中是最理想的存儲(chǔ)方式，但是需要不斷補(bǔ)充液氮，操作成本高。實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的存儲(chǔ)方式是-20℃和-80℃冰箱。那么這兩種方式會(huì)對(duì)代謝物產(chǎn)生怎樣的影響？Helen等對(duì)比了在-20 ℃和-80 ℃存儲(chǔ)不同時(shí)間下生物樣本中代謝物的穩(wěn)定性[10]。如下圖所示，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的存儲(chǔ)以后，-20℃和-80℃存儲(chǔ)的樣品整體代謝輪廓較沒(méi)有明顯差異，且和收集當(dāng)天較為類似。但部分代謝物如蛋氨酸、B族維生素、DHA和EPA在-20℃下存儲(chǔ)3個(gè)月以上會(huì)發(fā)生顯著降解[11,12]。因此，推薦將樣品存儲(chǔ)于-80℃冰箱，并盡快送檢。如果檢測(cè)物質(zhì)是易揮發(fā)、易氧化降解的，建議開(kāi)展預(yù)實(shí)驗(yàn)。

圖4. 尿液樣品PCA得分圖。A：收集當(dāng)天；B：1個(gè)月后；C：6個(gè)月后。空心的為-80℃存儲(chǔ)，實(shí)心的為-20℃存儲(chǔ)。

 

六.凍融對(duì)代謝物是否有影響？

環(huán)境溫度及變化均會(huì)對(duì)生物體內(nèi)的小分子代謝物產(chǎn)生影響。若將超低溫冰箱或液氮中的生物樣本直接放置到室溫環(huán)境，代謝物氧化降解或代謝酶活性恢復(fù)的時(shí)間差異，會(huì)引起代謝物組成和濃度的變化。因此，代謝組學(xué)樣本的解凍需要在冰浴上緩慢進(jìn)行。

代謝組學(xué)樣品應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。Helen等人發(fā)現(xiàn)尿液經(jīng)過(guò)九次凍融后，其代謝輪廓的差異相比個(gè)體差異（相同顏色代表同一個(gè)體）要?。▓D5）[10]。另一篇報(bào)道也發(fā)現(xiàn)凍融對(duì)生物樣本的影響并沒(méi)有我們想象的那么大，但對(duì)臨床樣本而言會(huì)有個(gè)體差異[6]。某些個(gè)體的樣品較為穩(wěn)定，而有些個(gè)體的樣品即使經(jīng)過(guò)一次凍融，其代謝輪廓也會(huì)發(fā)生劇烈波動(dòng)（圖6 A&B）。另外，不同代謝物種類對(duì)凍融的敏感度也不同，如肉堿經(jīng)過(guò)兩次凍融后，其濃度顯著降低（圖6 C）。因此，我們建議在存儲(chǔ)前有計(jì)劃地將樣品提前分裝好，盡量避免反復(fù)凍融。生物樣本凍融不超過(guò)六次為宜，且需在低溫下緩慢解凍。

 

圖5. 六個(gè)臨床尿液樣品反復(fù)凍融九次后的PCA得分圖。

 

圖6. 凍融對(duì)代謝輪廓的影響。

 

小結(jié)

對(duì)于代謝組學(xué)檢測(cè)，我們推薦血清樣本或EDTA抗凝血漿樣品，尿液樣品建議不要添加抗菌劑。樣品應(yīng)當(dāng)提前分裝好，并置于-80℃冰箱存儲(chǔ)，盡量避免反復(fù)凍融。

代謝組學(xué)糞便樣本收集方法

1糞便樣本的異質(zhì)性

從下圖中可以看出[1]，糞便收集器中不同位置取出的局部糞便樣品和整體勻漿后的糞便樣本（綠色）在PCA得分圖上有較為明顯的分布差異，且這種差異在不同個(gè)體之間是不一致的。相比于代謝物組，不同位置獲得的菌群測(cè)序結(jié)果卻差異不明顯，為了方便存儲(chǔ)，顯然不可能把所有收集到的新鮮糞便凍存。因此，臨床上凍存收集的新鮮糞便之前，需用無(wú)菌棒將樣品混勻。

 

圖1. 糞便不同部位代謝輪廓PCA圖，來(lái)源文獻(xiàn)[1]。

 

2樣本的運(yùn)輸

臨床上收集糞便樣本，可能會(huì)碰到病人在自己家中采集糞便的情況。此時(shí)，如何將糞便運(yùn)送至醫(yī)院是需要考慮的事情。如下圖所示，相比于5h、10h和24h，糞便在室溫和冷藏條件下放置1h，其代謝輪廓與新鮮糞便更為接近。但單獨(dú)比較新鮮糞便和放置1h后的糞便時(shí)可發(fā)現(xiàn)，室溫可致乙酸和戊酸含量顯著升高，而琥珀酸和富馬酸含量顯著降低。冷藏存儲(chǔ)則較為穩(wěn)定，其代謝物和新鮮糞便無(wú)明顯差異[1]。因此，患者在家中采集的新鮮糞便需置于冰上，并在1-2小時(shí)之內(nèi)送至醫(yī)院。

圖2. 室溫和冷藏不同時(shí)間的PCA圖，來(lái)源文獻(xiàn)[1]。

 

3糞水和原始糞便樣本的穩(wěn)定性

除了直接凍存收集的新鮮糞便，另一種方式是按1:2（糞便：水）或其他比例加入水或PBS，振蕩后，超速離心獲得糞水，以糞水的形式存儲(chǔ)。如下圖所示，新鮮糞便在-20℃放置1h后，代謝輪廓即發(fā)生了較為明顯的改變[1]?。凍存24h后糞水的代謝輪廓更穩(wěn)定，和新鮮糞水沒(méi)有明顯差異，但糞水在室溫下放置5h及冷藏下放置24h以上，代謝輪廓開(kāi)始明顯偏移[1]。需要指出的是，糞水樣品對(duì)于檢測(cè)疏水性強(qiáng)的化合物并不適合。另外，凍干糞便也是一種選擇。一般200mg的新鮮糞便可獲得約40mg的凍干糞便[2]。Lee等[3]對(duì)比了糞水和凍干糞便的差異，發(fā)現(xiàn)糞水中疏水性的長(zhǎng)鏈醇、酯和甾醇類損失明顯。凍干糞便亦有缺點(diǎn)，即凍干的過(guò)程會(huì)損失揮發(fā)性的代謝物，如SCFAs[4]。

圖3.不同溫度和時(shí)間存儲(chǔ)糞便和糞水樣本的PCA圖，來(lái)源文獻(xiàn)[1]。

 

4反復(fù)凍融的影響

如下圖所示，凍融兩次和三次的糞水樣本和新鮮糞水樣本在PCA圖上存在明顯區(qū)分，且可以分別和新鮮糞水樣本建立穩(wěn)健的OPLS-DA模型。反復(fù)凍融對(duì)氨基酸和尿苷有顯著影響[1]。因此，糞便樣本應(yīng)當(dāng)提前分裝，避免反復(fù)凍融。

圖4.不同凍融次數(shù)糞水樣本的PCA圖和差異代謝物，來(lái)源文獻(xiàn)[1]。

 

腸道內(nèi)容物

糞便反映的是整個(gè)腸道和宿主互作的最終結(jié)果，無(wú)法真實(shí)反映各個(gè)腸段的菌群活動(dòng)。菌群分泌的某些代謝物可能只是作為“中間產(chǎn)物”會(huì)被宿主重新吸收加以利用，所以代謝物在各腸段的分布不盡相同。以膽汁酸為例，十二指腸和回腸中的膽汁酸以結(jié)合型膽汁酸為主，豐度分別可達(dá)97.8%和89.7%，而盲腸和直腸中以非結(jié)合型膽汁酸為主，豐度分別可達(dá)97.7%和97.5%[5]。因此，腸道內(nèi)容物與糞便樣本相結(jié)合，能讓我們更全面地研究菌群和宿主之間互作的代謝關(guān)系。對(duì)于動(dòng)物模型，腸道內(nèi)容物易于獲得，常被用于菌群代謝物的檢測(cè)。菌群測(cè)序結(jié)果也顯示糞便和各腸斷的微生物相似度為0.7-0.9，并不能完全代表宿主各腸段微生物的真實(shí)情況[6]。

以各腸段名及糞便分別和16S作為關(guān)鍵詞在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)上檢索近五年的文章，搜索結(jié)果如下圖所示?？梢钥闯鰷y(cè)序樣本以糞便為主，腸道內(nèi)容物則以結(jié)腸和盲腸為主，可能是因?yàn)榻Y(jié)腸中微生物數(shù)量最為豐富，而盲腸因?yàn)橄鄬?duì)封閉的環(huán)境，菌群較為穩(wěn)定。代謝組學(xué)和測(cè)序是研究腸道菌群的兩大利器，常被結(jié)合使用。因此，我們可以選擇同一種樣本，對(duì)菌群測(cè)序結(jié)果和代謝組學(xué)結(jié)果作關(guān)聯(lián)分析，以深入挖掘菌群—宿主的互作機(jī)制。

圖5. 近五年腸道內(nèi)容物測(cè)序文章數(shù)量，數(shù)據(jù)來(lái)源Pubmed。

小結(jié)

糞便樣本雖然無(wú)創(chuàng)易得，但基質(zhì)復(fù)雜，我們需要盡量減少樣本收集、存儲(chǔ)和分析中引入的誤差。

對(duì)于糞便樣本的收集，我們需要注意以下幾點(diǎn)：

（1）原始新鮮糞便需要混勻；

（2）如在家中收集，樣本應(yīng)置于冰上并在1-2h之內(nèi)送至醫(yī)院進(jìn)行后續(xù)處理；

（3）糞便可以糞水結(jié)合糞便或凍干糞便的形式存儲(chǔ)；

（4）提前分裝，避免反復(fù)凍融。

對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，腸道內(nèi)容物也是檢測(cè)菌群代謝物的首選樣本之一，目前研究較多的是結(jié)腸和盲腸。我們可以選擇同一種腸道內(nèi)容物，結(jié)合測(cè)序數(shù)據(jù)，作關(guān)聯(lián)分析。

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