原創(chuàng)：?Frasergen?菲沙基因

微生物是地球上最古老的生命形式之一，它們體形微小，有些不為我們?nèi)庋鬯l(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，卻無(wú)處不在，盡管很多時(shí)候不被我們所注意，但卻非常重要，是整個(gè)自然生態(tài)鏈中不可或缺的一部分。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展及成本的降低，使得微生物研究更加深入和廣泛，研究成果不斷涌現(xiàn)于各大期刊雜志，包含Science、Nature、Cell等國(guó)際頂尖學(xué)術(shù)期刊。

如何選擇不同的微生物宏組學(xué)解決方案？

基于高通量測(cè)序研究微生物宏組學(xué)的解決方案：擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組測(cè)序、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，那么如何根據(jù)研究目的選擇不同的宏組學(xué)解決方案呢？

?如果我們想知道環(huán)境中存在哪些微生物？每種微生物的豐度情況如何？

答：擴(kuò)增子測(cè)序（16S/18S/ITS可變區(qū)擴(kuò)增子、全長(zhǎng)16S/18S/ITS）

?如果我們不僅想知道環(huán)境中存在哪些微生物，還想知道微生物有哪些功能？

答：二代宏基因組測(cè)序、三代宏基因組測(cè)序

?如果我們進(jìn)一步想知道這些環(huán)境微生物正在行使什么功能？

答：宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

擴(kuò)增子測(cè)序

擴(kuò)增子測(cè)序是對(duì)特定長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物或者捕獲片段進(jìn)行測(cè)序，16S、18S、ITS rDNA 被認(rèn)為是最適于細(xì)菌、真核微生物、真菌系統(tǒng)分類(lèi)鑒定的指標(biāo)。

 

宏基因組?(Metagenome)

以環(huán)境中全部細(xì)菌、真菌、古菌等的基因組遺傳物質(zhì)DNA為研究對(duì)象，進(jìn)行de novo組裝，以基因?yàn)檠芯繂卧?，進(jìn)行物種多樣性、基因結(jié)構(gòu)、差異基因和功能基因等的研究。

環(huán)境微生物應(yīng)用領(lǐng)域

宏組學(xué)測(cè)序適用于各種自然環(huán)境及人或動(dòng)物微生態(tài)的研究，下面讓我們來(lái)看看它的運(yùn)用領(lǐng)域：

常見(jiàn)樣本類(lèi)型

宏組學(xué)的應(yīng)用非常廣泛，涉及各種各樣的環(huán)境類(lèi)型，土壤、水體、污泥、食品發(fā)酵液、小鼠腸道、反芻動(dòng)物瘤胃等；人腸道微生物的研究中，宏組學(xué)的運(yùn)用也非常的廣泛，涉及各種各樣的樣本類(lèi)型，胃黏膜、唾液、肺部灌洗液、分泌物、糞便等。

參考文獻(xiàn)

1.????Ni J, Shen T C D, Chen E Z, et al. A role for bacterial urease in gut dysbiosis and Crohn’s disease[J]. Science Translational Medicine, 2017, 9(416): eaah6888.

2.????Wilck N, Matus M G, Kearney S M, et al. Salt-responsive gut commensal modulates T H 17 axis and disease[J]. Nature, 2017, 551(7682): 585.

3.????Thompson L R, Sanders J G, McDonald D, et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity[J]. Nature, 2017.

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16S與宏基因組的區(qū)別

 

16S rDNA測(cè)序及宏基因組測(cè)序都是研究微生物的重要方法，那么這兩者到底有什么區(qū)別呢？什么情況下選擇16S測(cè)序？什么情況下選擇做宏基因組測(cè)序？

測(cè)序原理不同

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rDNA的DNA序列，具有高度的保守性。該序列具有10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)可變區(qū)域（V1-V9），其中保守區(qū)域在細(xì)菌間差異不大，高可變區(qū)具有屬或種的特異性。

16S rDNA的結(jié)構(gòu)

對(duì)16S rDNA某個(gè)高可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，用于研究環(huán)境微生物中細(xì)菌或古菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性。通過(guò)對(duì)某一段高變區(qū)序列（V4區(qū)或V3-V4區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，得到1500bp左右的序列。

16S的測(cè)序原理

宏基因組測(cè)序則是將微生物基因組DNA隨機(jī)打斷成350bp的小片段，然后在片段兩端加入通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，再通過(guò)組裝的方式，將小片段拼接成較長(zhǎng)的序列。

宏基因組測(cè)序原理

 

研究?jī)?nèi)容不同

16S測(cè)序主要研究群落的物種組成、物種間的進(jìn)化關(guān)系以及群落的多樣性；宏基因組測(cè)序在16S測(cè)序分析的基礎(chǔ)上還可以進(jìn)行基因和功能層面的深入研究：

	16S	宏基因組??
物種組成??	√ ?	√
物種豐度	√	√
基因預(yù)測(cè)??	X	√
功能注釋??	X	√
代謝通路??	X	√
功能分析??	X	√

 

鑒定到的物種及深度不同

??在界水平上，宏基因組有細(xì)菌、古菌、真菌和病毒的信息，而16S只有細(xì)菌和古菌的信息。

??在種水平上，宏基因組測(cè)得的物種種類(lèi)高于16S，是因?yàn)?6S這一測(cè)序技術(shù)的限制，鑒定到種水平的很少。

??在門(mén)、綱、目、科、屬水平上，宏基因組測(cè)得的物種種類(lèi)沒(méi)有16S多，因?yàn)?6S選的是某一可變區(qū)，可測(cè)到低豐度的物種的種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于宏基因組，因此16S測(cè)得的物種種類(lèi)在門(mén)、綱、目、科、屬分類(lèi)水平上更豐富。

??對(duì)于16S測(cè)序而言，任何一個(gè)高變區(qū)或幾個(gè)高變區(qū)，盡管具有很高的特異性，但是某些物種（尤其是分類(lèi)水平較低的種水平）在這些高變區(qū)可能非常相近，能夠區(qū)分它們的特異性片段可能不在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)。

??宏基因組測(cè)序通過(guò)對(duì)微生物基因組隨機(jī)打斷，并通過(guò)組裝將小片段拼接成較長(zhǎng)的序列。因此，在物種鑒定過(guò)程中，宏基因組測(cè)序具有較高的優(yōu)勢(shì)。

 

研究重點(diǎn)不同

16S研究側(cè)重于解答群落結(jié)構(gòu)，而宏基因組測(cè)序則側(cè)重于解答菌落的功能。

一句話(huà)總結(jié)：宏基因組測(cè)序研究是16S測(cè)序分析的升華與補(bǔ)充。

研究微生物群落結(jié)構(gòu)的組成差異及特征，選擇16S測(cè)序；研究微生物的群落結(jié)構(gòu)、物種分類(lèi)、基因功能及代謝網(wǎng)絡(luò)，選擇宏基因組測(cè)序；當(dāng)然我們還可以采用16S與宏基因組測(cè)序聯(lián)合的研究思路，即大樣本量進(jìn)行16S測(cè)序，根據(jù)差異物種，選部分代表樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

全長(zhǎng)16S rDNA測(cè)序

 

16S rDNA長(zhǎng)度大約為1500bp左右，三代平臺(tái)的PacBio Sequel的平均讀長(zhǎng)為8-12Kb，因此結(jié)合該平臺(tái)可以成功測(cè)序獲得16S/18S的全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)序列信息不僅能提高物種鑒定的分辨率，還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度，從而能更加真實(shí)的還原樣本中微生物的群落結(jié)構(gòu)。

全長(zhǎng)16S產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

高通量--能同時(shí)分析群落中所有的微生物

高數(shù)據(jù)質(zhì)量--采用PacBio的CCS模式，對(duì)序列自我矯正，數(shù)據(jù)一致性準(zhǔn)確率高

高分辨率--分析16SrDNA全長(zhǎng)，分類(lèi)精準(zhǔn)到種。

	二代擴(kuò)增子	三代全長(zhǎng)擴(kuò)增子
樣本要求	無(wú)嚴(yán)格樣品要求，只要能擴(kuò)出相應(yīng)片段
擴(kuò)增區(qū)域	1-2個(gè)高變區(qū)，如16S的V4/V5	全長(zhǎng)序列
測(cè)序平臺(tái)	Illumina?MiSeq/HiSeq	PacBio?Sequel
測(cè)序數(shù)據(jù)量	≥30,000?Tags	≥?5,000?CCS
分析內(nèi)容	微生物群落組成與豐度
結(jié)果準(zhǔn)確性	一般	準(zhǔn)確度高
成本	低	較高

 

經(jīng)典案例分析^[1]

樣品來(lái)源：模擬菌群（已知單菌混合）和湖水樣本

測(cè)序策略：PacBio RSII（FL-16S，PhyloTags）

Illumina MiSeq（16S-V4區(qū)，V4 iTags）

分析思路：

①模擬菌群驗(yàn)證PhyloTags準(zhǔn)確性；

②湖水菌群樣本PhyloTags和V4 iTags比較

③ PhyloTags提高菌群分辨率的原因解析

（1）模擬群落驗(yàn)證SMRT測(cè)序

研究人員使用含有23個(gè)細(xì)菌參考基因組的模擬群落得到一系列PacBio 16s rRNA基因序列數(shù)據(jù)，并將SMRT技術(shù)產(chǎn)生的全長(zhǎng) 16s rRNA基因序列稱(chēng)為PhyloTags。5個(gè)模擬群落的高質(zhì)量PhyloTags數(shù)據(jù)成功分成22個(gè)OTU，每個(gè)OTU的16s rRNA基因相似度高于97%。通過(guò)質(zhì)量分選出來(lái)的質(zhì)量最好的PhyloTag對(duì)模擬基因組16s rRNA基因的相似度是99.5%。另外，5個(gè)PhyloTag技術(shù)重復(fù)的相關(guān)性非常好，相互之間的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到96%以上，并且與鳥(niǎo)槍法打斷的meta序列具有很強(qiáng)相關(guān)性。在模擬群落實(shí)驗(yàn)中，PhyloTags的結(jié)果可以與傳統(tǒng)iTag測(cè)序結(jié)果相媲美。

 

（2）Sakinaw湖水菌群分析

Sakinaw湖含有豐富的微生物類(lèi)群，研究人員選取8個(gè)不同深度的湖水進(jìn)行采樣，分別對(duì)這些樣本進(jìn)行PhyloTag和V4 iTag分析。結(jié)果表明，V4 iTags數(shù)據(jù)中有0.2-4.1%的微生物在門(mén)水平上無(wú)法區(qū)分，而PhyloTags則能在門(mén)水平上將這些微生物完全區(qū)分。比較各個(gè)深度的PhyloTag和V4 iTag數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)深度在50-120m時(shí)，兩者在門(mén)水平上的微生物分類(lèi)差異明顯。在環(huán)境樣本中，短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)在復(fù)雜群類(lèi)區(qū)分中失去優(yōu)勢(shì)，而PhyloTags則能在屬水平上對(duì)菌群進(jìn)行區(qū)分。

（3）PhyloTags提高菌群進(jìn)化分類(lèi)的分辨率

為了評(píng)估擴(kuò)增子長(zhǎng)度對(duì)群體分析的影響，研究人員隨機(jī)抽取了Sakinaw樣本中的1818條PacBio FL序列和它們對(duì)應(yīng)的二代測(cè)序產(chǎn)生的V4區(qū)域序列進(jìn)行成組比較。結(jié)果表明，在多個(gè)實(shí)例中相同的序列對(duì)表現(xiàn)出來(lái)不同的鑒定結(jié)果，產(chǎn)生這些結(jié)果的原因是16s rRNA基因的突變位點(diǎn)分布并不均勻，高估或低估這些突變都將影響微生物群落的分類(lèi)。

綜上所述，PacBio全長(zhǎng)16S rDNA測(cè)序可提供更準(zhǔn)確的物種分類(lèi)和更多的物種鑒定，在系統(tǒng)發(fā)育、群落鑒定和代謝通路預(yù)測(cè)方面都更有優(yōu)勢(shì)。

 

參考文獻(xiàn)：

1.Singer E, Bushnell B,Coleman-Derr D, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling[J]. The ISME journal(2016).

 

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