原創(chuàng)：?安必奇生物?北京安必奇生物科技有限公司?1月12日

基因敲除的概念

基因敲除，又稱為基因打靶，是一種基因工程技術(shù)，通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA 同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的?；蚯贸夹g(shù)的優(yōu)點是位點精確、成功率高，并且有很廣泛的應(yīng)用，可用于微生物、動植物的品種改良，創(chuàng)建生物膜性、疾病機理研究、免疫應(yīng)用、精準(zhǔn)醫(yī)療（遺傳病的靶向治療）等。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，現(xiàn)階段技術(shù)比較成熟的有CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。

微生物的基因敲除

在微生物領(lǐng)域，基因敲除除了可以用來進(jìn)行菌種改良，還常常用來研究基因功能。微生物的基因組研究非常重要，微生物中的酶基因和代謝過程相關(guān)的功能基因，可能對整個現(xiàn)代生物科技、工業(yè)和農(nóng)業(yè)發(fā)展都起到推動作用，比如抗生素的研發(fā)、工業(yè)用酶的發(fā)現(xiàn)、微生物發(fā)酵行業(yè)等。微生物基因敲除，常用的主要有兩種方法，一種是基于同源重組系統(tǒng)，另一種是利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。

細(xì)菌基因組編輯技術(shù)

01

同源重組系統(tǒng)

同源重組是指減數(shù)分裂或者有絲分裂的過程中，相同或者相似的DNA序列間發(fā)生交叉互換的現(xiàn)象。基于同源重組系統(tǒng)的微生物基因組編輯技術(shù)實驗流程簡單，利用限制性內(nèi)切酶、連接酶和PCR技術(shù)等就可以對DNA片段或者質(zhì)粒等基因組進(jìn)行改造，實現(xiàn)基因敲除、敲入、突變等一系列修飾操作。

細(xì)菌基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用自身的Rec系統(tǒng)對外源進(jìn)入的DNA進(jìn)行同源重組，從而實現(xiàn)目標(biāo)基因的等位替換。通過設(shè)計靶基因的同源融合片段，將其克隆至自殺載體中，自殺載體通過接合輸入到靶細(xì)菌。通過抗生素篩選細(xì)菌基因組靶位點整合有自殺載體的插入突變株。在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活。最后通過PCR鑒定即可獲得目的基因的缺失突變株。FLP重組酶機理基于Red同源重組技術(shù)敲除的技術(shù)路線

02

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

CRISPR-Cas9作為先進(jìn)的基因編輯技術(shù)，在微生物基因組改造方面有著明顯的優(yōu)勢，該方法速度快，無痕，便于后續(xù)研究。需要重點提及的是CRISPR/Cas微生物基因敲入系統(tǒng)，它是在Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，且有一段高度同源的DNA修復(fù)模板存在的情況下，生物體內(nèi)啟動HDR修復(fù)路徑，將一段外源DNA定點插入基因內(nèi)部。同源性定向修復(fù)（HDR）途徑，對比NHEJ修復(fù)途徑，同源性定向修復(fù)（HDR）途徑是更為精確的修復(fù)機制。這種修復(fù)機制主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入。在該修復(fù)路徑中，需要將一段與預(yù)期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復(fù)模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細(xì)胞中。這種Cas9 系統(tǒng)結(jié)合其它的基因工程技術(shù)，用于對基因組中目標(biāo)DNA 進(jìn)行改造，必將在生物、農(nóng)業(yè)、環(huán)境研究及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

CRISPR/Cas9基因敲除。

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