原創(chuàng)：?微生太?微生態(tài)?2018-12-25

用于宏基因組測序分析的人類糞便樣品取樣方法

江舜堯?微生態(tài)?2017-06-29

一、樣本篩選

1.如果受試者存在以下情況，則需剔除：

（1）5年內(nèi)有過胃腸道大手術(shù)的（膽囊切除術(shù)和闌尾切除術(shù)）；

（2）有過主要腸道切除手術(shù)；

（3）炎癥性腸病（IBD），包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩?。–rohn’s disease）或不確定的結(jié)腸炎；

（4）腸易激綜合癥（IBS）；

（5）持久性、傳染性胃腸炎、結(jié)腸炎或胃炎;持續(xù)或慢性腹瀉的病因不明，艱難梭狀芽胞桿菌感染（復發(fā)）或幽門螺桿菌感染（未治療）；

（6）慢性便秘；

（7）歷史性的胃或腸道潰瘍、胃腸道出血、腹痛、消化不良、胃腸里急后重（下墜）或排便困難，胃腸道或結(jié)腸息肉或包塊或發(fā)育不良或癌癥，以及腹瀉或傳染性胃腸炎；

（8）藥物治療記錄：含堿式水楊酸鉍，?Pepto-Bismol，?Kaopectate，?Maalox Total Relief， Bismatrol，?Pink Bismuth，?Stomach Relief，?Stress，?Walgreens Soothe?和其它類似的鉍堿式水楊酸鹽的藥物成分的藥物。

2.對于存在歷史性胃腸道疾病患者執(zhí)行簡單臨床檢查：腹部壓痛、疼痛及肛門疾病。

二、準備材料

微生太^?糞便采集包一套：內(nèi)含無菌糞便采集管三個，mark筆一支，一次性手套一雙，自封袋一個；冰或冰袋或干冰，冰盒一個。

三、收集方法

1.自然排便法

（1）拆開微生太?糞便采集包，在采集管管壁和管蓋以及自封袋上都寫上樣品名稱（樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)大于3小于9）；

（2）排便前先排盡尿液，以免尿液污染；將馬桶沖洗干凈，排便在無水處，然后用取樣勺挖取沒有接觸空氣的糞便2g（1-2小勺），擰緊蓋子，重復取3管，保存于自封袋；

（3）將自封袋放入冰盒，用冰或冰袋或干冰填埋，以制造低溫環(huán)境，阻止菌群生長，2小時內(nèi)保存到-80℃冰箱（如果是干冰填埋，只要在干冰揮發(fā)完之前送達即可）；

（4）所有樣品收集完畢后，將每人三管中的一管糞便寄送到北京微生太科技有限公司實驗室，進行宏基因組測序分析或菌群結(jié)構(gòu)譜測序分析，寄送時需要干冰冷凍。

2.直腸拭子法

不易獲得糞便時，可采用直腸拭子法采集。肥皂、水和?70%的酒精清潔肛門周圍，將無菌拭子用生理鹽水濕潤后插入肛門?4～5cm(幼兒?2～3cm)，在肛門括約肌處輕柔的旋轉(zhuǎn)，于肛門隱窩處取樣，可在拭子上明顯見到糞便，然后保存在無菌采樣管。其他步驟參考“自然排便法”。

四、糞便微生物采樣神器

Longsee糞便微生物基因組保護液套裝外觀

該套裝尤其適合采集和保護糞菌樣本。具有以下優(yōu)點：（1）采集的樣本在常溫下放置14天，樣本中菌群種類和豐度與新鮮樣本的一致；（2）采集后樣本可在常溫下運輸；（3）DNA的收獲率高、完整性好、測序穩(wěn)定性好。

用于菌群結(jié)構(gòu)譜或宏基因組測序分析的實驗動物腸道微生物取樣方法

原創(chuàng)：?江舜堯?微生態(tài)?2017-06-30

一、準備材料

超凈工作臺，棉花，酒精，鑷子；無菌凍存管，?mark筆，一次性手套，?自封袋；冰或冰袋或干冰，冰盒。?以上是糞便收集方法中所用物品，如果取腸道內(nèi)容物的話另外準備解剖剪等。

二、糞便收集方法

1.?超凈工作臺滅菌15分鐘，通風5分鐘，酒精擦拭工作臺桌面（實在沒有超凈工作臺就盡可能找潔凈的場所，盡量避免外源菌污染）;?

2.?在無菌凍存管管蓋和管壁上都寫上樣品名稱，注意，樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)不小于3且不大于9；

3.?腹部按摩法促使動物（以大鼠為例）在超凈工作臺排便，至少兩粒糞便，每粒糞便保存在一個無菌凍存管中，其中一粒送給北京微生太科技有限公司（簡稱微生太），另一粒自己保存在-80℃冰箱備用；如果是小鼠，糞便粒數(shù)加倍，其他動物糞便量參考大鼠即可；

4.根據(jù)分組等情況，將凍存管保存在自封袋中，自封袋緩存在冰上，以避免菌群生長；

5.酒精擦拭工作臺桌面，繼續(xù)取樣；

6.樣品采集后2小時內(nèi)保存到-80℃冰箱；

7.所有樣品采集完畢后聯(lián)系微生太取樣。微生太將派送干冰到樣品所在地，將樣品放進派送干冰的泡沫盒，封嚴后交給物流師傅既可。?

?三、腸道內(nèi)容物收集方法

其他步驟參考“糞便收集方法”，第三步參考方法如下：解剖動物腹部，取出腸道，剪開選定的腸段，擠出該腸段的腸道內(nèi)容物于無菌凍存管中，體積至少相當于兩粒大鼠糞便，混勻后分裝成兩管，其中一管送給微生太，另一管自己保存在-80℃冰箱備用。注意用酒精棉球和酒精燈滅菌后再取下一只動物的樣品。

用于菌群結(jié)構(gòu)譜或宏基因組測序分析的口腔微生物取樣方法

原創(chuàng)：?江舜堯?微生態(tài)?2017-07-04

一、樣本篩選

1、如果受試者存在以下情況，則需剔除。

（1）慢性口干；

（2）牙周袋≥ 4 mm；

（3）未處理的空洞齲病變或者口腔膿腫；

（4）癌前或癌損傷；

（5）念珠菌?。?/span>

（6）口臭；

（7）各種原因引起的牙齒缺失 8 顆牙齒以上者；

（8）多于 10%的探診位點出血。

2、篩選過程需要專業(yè)的口腔檢測設備及操作方式。

3、詳細調(diào)查最近的口腔感染、炎癥、膿皰、潰瘍、良性或者惡性包塊等口腔病史。并記錄口腔預防或者牙周病治療的時間長度。

4、完整的軟組織檢查，包塊齒齦、口腔粘膜、舌、咽、扁桃體，并詳細記錄結(jié)果。

5、記錄牙齒的數(shù)量，受試者應至少有 24 顆牙齒。

6、記錄未處理的空洞性齲齒損傷和修復的牙齒的數(shù)量。

7、至少 6 項牙周檢查，包括mesiofacial, midfacial, distofacial, mesiolingual, midlingual,distolingual.

8、牙周的檢查應該包括完整的口腔，探診深度、探針出血。

二、取樣部位

主要包含唾液、軟組織部分（舌背部、上顎、口腔粘膜、角質(zhì)化的牙齦、腭扁桃體、咽喉）、堅硬部分（齦下牙菌斑和齦上的牙菌斑），各部位例圖如下：

三、收集方法

1、唾液

（1）要求受試者保持唾液在口中持續(xù)至少?1min，然后吐到滅菌后的離心管中，為了保證收集到足夠多的唾液（2-5ml），這個過程通常需要重復多次；

（2）唾液的產(chǎn)生可通過咀嚼天然原味口香糖進行刺激（1.0-1.5g）。受試者要有規(guī)律地咀嚼，當有足夠的唾液時，吐到滅菌的離心管中，之后的步驟與?1 同；

（3）收集好滅菌管后，用自封袋封存，置于冰上，2h?內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥?80°保存?zhèn)溆谩?/span>

注意：在無菌管管蓋和管壁上都寫上樣品名稱，樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)不小于3且不大于9；下同。

2、軟組織樣本

所有的軟組織樣本都用拭子刮取。刮取后，立即在含有?750ul 的 MoBiobuffer 中渦旋。拭子上的海綿應該在離心管壁多按壓幾次，約 20s，以確保將細菌轉(zhuǎn)移到 buffer 中。然后將buffer 在-80°冷凍保存?zhèn)溆谩?/span>

（1）舌背部：刮取舌中心1cm²的部位，約?5s；

（2）上顎：刮取整個堅硬的上顎，約10s；

（3）口腔粘膜：刮取左側(cè)和右側(cè)的整個口腔粘膜區(qū)，每側(cè)約10s，要注意不要接觸到牙齒；

（4）角質(zhì)化的牙齦：刮取顎前方的牙齦，約10s；

（5）腭扁桃體：分別刮取左側(cè)和右側(cè)的腭扁桃體5s；

（6）咽喉：由于條件反射，這個部位非常難收集，若需要取，建議取完別的部位后再取。慢慢地將拭子放入咽部后方，約?5s。注意不要刮到扁桃體。

3、堅硬部位樣本

（1）齦上牙菌斑：記錄牙菌斑取自哪顆牙齒，如臼齒，前臼齒，門牙。首先干燥即將取樣的部位，其次用Gracey?刮匙刮取盡可能多的牙菌斑，最后將刮匙浸沒到buffer?中，約?4-5s，將刮匙表面的物質(zhì)都收集到滅菌管中。收集好滅菌管后，用自封袋封存，置于冰上，2h內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥?80°保存?zhèn)溆茫?/span>

（2）齦下牙菌斑：與齦上牙菌斑處理方式相同，需要注意要清除殘留的齦上牙菌斑，并注意要丟棄有出血的樣本。

用于菌群結(jié)構(gòu)譜或宏基因組測序分析的人類鼻腔微生物取樣方法

原創(chuàng)：?江舜堯?微生態(tài)?2017-07-05

一、樣本篩選

1、如果受試者存在以下情況，則需剔除：

（1）樣品采集當天，鼻腔佩戴飾品或其他金屬，記錄鼻腔穿刺情況；

（2）流感病毒疫苗注射后未滿 28 天。

2、詳細調(diào)查任何時間段患有的鼻竇炎、鼻炎、上呼吸道感染的病史，并記錄疾病治療的時間段，病史包括鼻部檢查、鼻腔外科手術(shù)。

3、對鼻孔臨床檢查（特別是前鼻孔），檢查鼻腔是否有炎癥、息肉、包塊、鼻涕等。

二、準備材料

2ml 無菌螺旋蓋收集管（如MoBio 收集管）、750μ l樣本收集液（如MoBio buffer）、Mark筆、無菌棉拭子、自封袋、一次性手套、碎冰或冰袋（最好是干冰）及冰盒。

三、收集方法

1、用Mark筆在收集管管壁和管蓋上寫上樣品名稱，樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)不小于3且不大于9；

2、利用無菌的棉拭子在鼻前孔黏膜層（約 2.5 cm 處）輕輕旋轉(zhuǎn)式擦拭 2 次，蘸取黏膜上分泌物，緩慢抽出；

3、樣本采集后應立即放入含有 750μ L MoBio buffer 的滅菌管中；棉拭子應多次按壓管壁不少于 20 s，確保微生物從拭子轉(zhuǎn)移到溶液中；左右鼻腔樣本采集后，匯總成一個樣本；

4、收集好收集管后，用自封袋封存，置于冰上，2h 內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥?80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

備注：如果實在不方便購買保存液，可以將棉團剪下直接保存在沒有保存液的保存管中，將保存管用冰或冰袋或干冰冷卻，2h 內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥?80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

四、注意事項

研究者采集樣本時，應佩戴一次性無菌手套，避免接觸實際采樣區(qū)域及其周圍區(qū)域；如果發(fā)生接觸，手套可能被污染，應該立即更換手套。

用于菌群結(jié)構(gòu)譜或宏基因組測序分析的人類陰道微生物采樣方法

原創(chuàng)：?江舜堯?微生態(tài)?2017-07-07

一、志愿者篩選，排除以下志愿者

1. 有尿失禁者；
2.?子宮切除者；
3.?治療過中毒性休克綜合征者；
4.?5年前，患過宮頸或陰道非典型性增生者；

5.?兩年前，被診斷有濕疣或人類乳頭狀瘤病毒（HPV）者；
6.?2個月前有患過念珠菌病，尿路感染或活躍性病（特別是衣原體、淋病、梅毒、生殖器皰疹、滴蟲?。┱撸?/span>

7. 另外，記錄陰道檢查結(jié)果及 pH 檢測結(jié)果，并且標本采集前，標本采集前?24-48h?禁欲、禁盆浴、禁陰道灌洗及局部上藥，搜集月經(jīng)期時間。

二、采樣方法

1.?在無菌拭子管管蓋和管壁上都寫上樣品名稱，注意，樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)不小于3且不大于9；

2.?常規(guī)無菌操作消毒外陰或尿道口，用擴陰器擴張陰道；

3. 用無菌棉拭子拭取宮頸口或?qū)m頸后穹窿的分泌物，不可碰及陰道壁，圓周滾動 5 次，放入無菌拭子管中（可不添加緩沖液），迅速放置在冰上或者直接存放在-80 攝氏度冰箱中備用。

三、人類陰道中常見菌群

主要的常住菌有乳桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、棱狀桿菌、糞鏈球菌等。主要的過路菌有金黃色葡萄球菌、腸桿菌、丙酸桿菌、消化鏈球菌、韋榮球菌等。健康婦女陰道分泌物中，厭氧菌與需氧菌的比例為?5:1，活菌數(shù)為10²-10⁹/ml，菌數(shù)可達?8x 10⁷/ml，其中常住的真菌是假絲酵母菌；陰道毛滴蟲屬于過路原蟲；常分離出皰疹病毒-2 型（HSV-2）和巨細胞病毒等。在正常陰道微生物群中，95%為乳酸桿菌。乳酸桿菌是婦女陰道內(nèi)正常微生物群的優(yōu)勢菌，對陰道微生態(tài)平衡有明顯的調(diào)節(jié)作用。

四、參考文獻

1. Association of the Vaginal Microbiota with Human Papillomavirus Infection in a Korean Twin Cohort, 2013, Plos one.

2. Pregnancy’s Stronghold on the Vaginal Microbiome, 2013, Plos one.

3. Temporal Dynamics of the Human Vaginal Microbiota, 2012, Sci Transl Med.

4. Vaginal microbiome of reproductive-age women, 2010, PNAS.

用于菌群結(jié)構(gòu)譜或宏基因組測序分析的皮膚微生物取樣方法

江舜堯?微生態(tài)?2017-07-09

一、樣本篩選

1、如果受試者存在以下情況，則需剔除：
（1）采樣前7天，臉部，頭皮，脖子，胳膊，前臂或者手使用過抗生素或者萜類物質(zhì)者；

（2）臉部，胸部，背部或者肩膀有痤瘡者；

（3）頭皮，臉，脖子，手臂，前臂或者手上有水泡，膿皰，瘡，膿腫，腐爛或者潰瘍者；

（4）在4c²取樣部位處有一處水泡，膿皰，瘡，膿腫，腐爛，潰瘍，蘚，傷口，裂紋或者色素及粉紅色的皮膚修復區(qū)者；

（5）身上有多處粉色或紅色皮膚區(qū)域者（暗指牛皮癬或者濕疹患者）；

（6）手掌或者腳掌皮膚增厚或者有裂紋者；

（7）兩周之內(nèi)，每天使用去屑洗發(fā)水都不能清理干凈頭皮屑者；

（8）身體一處或者多處有散發(fā)型皮疹者。

2、志愿者的皮膚檢查要在燈光良好情況下進行，并且要對全身有全面徹底的檢查。

3、耳后的折痕（左右耳后面）和兩個胳膊腋窩要仔細檢查。

二、準備材料

1、無菌螺旋蓋收集管（如 MoBio 收集管）；

2、無菌生理鹽水；

3、標簽紙；
4、Mark 筆和簽字筆；

5、無菌脫脂棉簽；

6、密封塑料袋；

7、-80°C冰箱；

8、一次性手套；

9、碎冰或冰袋，最好是干冰；

10、冰盒。

三、收集方法

1、在無菌拭子管管蓋和管壁上都寫上樣品名稱，注意，樣品名稱只能用英文字母或阿拉伯數(shù)字或兩者的組合，而且字符數(shù)不小于3且不大于9；

2、將無菌的脫脂棉簽在無菌生理鹽水中浸濕，在實驗目的區(qū)域擦拭30s，擦拭面積4c²；

3、樣本采集后應放入無菌螺旋蓋收集管；收集好收集管后，用自封袋封存，置于冰上，2h 內(nèi)運輸?shù)綄嶒炇遥?80°C保存。

四、人類皮膚常見菌群

一類為常駐菌群，較固定地寄生于皮膚，數(shù)量和菌種的組成保持相對穩(wěn)定；另一類為暫駐菌群，主要存在于暴露部位的皮膚，其數(shù)量和菌類有很大的變化。此外，還有一些微生物偶爾存在于少數(shù)人體上，稱為偶存菌，僅在短時期內(nèi)附著于皮膚和增殖，此受環(huán)境及常駐菌群活性的影響。常駐菌群寄生在角質(zhì)層表面和表皮的最外層中。常見的有：微球菌科（包括凝固酶陰性葡萄球菌、類球菌、微球菌屬），棒狀微生物（包括棒狀桿菌屬、短頸細菌屬），丙酸菌屬，糠秕孢子菌屬。

五、參考文獻

1、Distinct cutaneous bacterial assemblages in a sampling of South American Amerindians and US residents, The ISME Journey, 2013.?

2、Skin Microbiome Imbalance in Patients with STAT1/STAT3 Defects Impairs Innate Host Defense Responses, J Innate Immun, 2013.?

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微生態(tài)?2018-08-07

方法具體如下：

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