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技術(shù)特邀責(zé)編團(tuán)企
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轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室
你身邊的DNA操作技術(shù)團(tuán)隊(duì)
轉(zhuǎn)導(dǎo)生物深耕分子生物學(xué)技術(shù)十二載，是國內(nèi)極具信譽(yù)的DNA操作技術(shù)團(tuán)隊(duì)，堅(jiān)信再普通的技術(shù)做到極致也能有自己的品牌。轉(zhuǎn)導(dǎo)生物拓展RACE技術(shù)應(yīng)用，訂單量、完成率、正確率、保真性在生物技術(shù)領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位。每年10000+RACE序列擴(kuò)增訂單，為其積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，配合組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，大幅度提升RACE方法獲取目的基因的速度與準(zhǔn)度。轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室作為國內(nèi)RACE技術(shù)領(lǐng)域的翹楚，聚生物特邀其作為RACE聚透技術(shù)板塊的責(zé)編團(tuán)企。
RACE技術(shù)概述
RACE（Rapid amplification of cDNA ends）是通過PCR 進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)[1]，是一種基于低豐度mRNA?反轉(zhuǎn)錄和PCR?技術(shù)以全長cDNA中間的已知區(qū)域序列為起點(diǎn)，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本，快速擴(kuò)增cDNA的5′?和3′?末端的未知區(qū)域，從而獲得mRNA或cDNA的完整序列，該方法也被稱為錨定PCR[2]和單邊PCR[3]。RACE技術(shù)有3′ RACE和5′?RACE?，主要應(yīng)用于全長cDNA序列的獲得、克隆同源基因同源片段、克隆已知片段的旁側(cè)序列、cDNA文庫的構(gòu)建和篩選等[5]。常見的RACE技術(shù)有：經(jīng)典RACE、Adapter-Ligate RACE、RLM-RACE、環(huán)形RACE、RCA-RACE和T-RACE。
（轉(zhuǎn)導(dǎo)生物責(zé)任編輯）
技術(shù)詳情
利用mRNA的3′?末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，用RNase降解模板mRNA。然后用一個基因特異引物GSP1（Gene specific primer）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（Universal primer mix）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3′ 末端的DNA片段擴(kuò)增出來[4]。（圖1）
利用mRNA的3′?末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo（dT）30MN作為鎖定引物在逆轉(zhuǎn)錄MMLV酶，由GSP1引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈。將RNA-DNA雜合鏈用RNase降解模板鏈mRNA純化cDNA第一鏈，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈的3′?端加入連續(xù)的PolyC尾巴，用一個含有部分接頭序列的通用錨定引物UPM作為上游錨定引物和一個基因特異引物GSP2作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因5′ 末端的DNA片段擴(kuò)增出來，用巢式PCR檢測[4]。（圖2）
最后從2個有相互重疊序列的3′?和?5′?末端RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA或分析3′?和?5′?末端RACE產(chǎn)物序列合成相應(yīng)的引物擴(kuò)增出全長cDNA?序列。
（1）提取RNA的菌液、細(xì)胞或組織樣品，要確保新鮮足量。
（2）在RNA提取過程中應(yīng)注意RNA的完整性和純度，防止RNA降解。
（3）使用嗜熱DNA聚合酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，消除5’端因高GC含量導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的影響，減少截短的cDNA 產(chǎn)生。
（4）選擇適合的RACE技術(shù)擴(kuò)增目的片段。
（5）選擇適合的加尾堿基，在oligo（dT）引物3’末端使用引發(fā)效率高的堿基如CC、GG、CG、GC。
（6）使用高特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
（1）制備和抽提polyA+RNA，使用滅菌的蒸餾水，不要使用DEPC處理過的水。
（2）純化完mRNA后用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量。
（3）3’RACE需要的RNA>15 μg,5′ RACE需要的RNA＞25 μg。
（4）DNA的合成起始于polyA+RNA，如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。
（5）Race引物設(shè)計(jì)：堿基16-22 bp，GC含量控制在50%-70%，Tm值在50-60 ℃。（具體條件根據(jù)使用的試劑盒設(shè)定）
（6）如果用重疊片段檢測設(shè)計(jì)的引物，GSP1和GSP2之間至少100-200個堿基。
（7）采用SMART-RACE熱啟動PCR和降落PCR來提高PCR反應(yīng)的特異性，降落PCR要求GSP的Tm值≥70℃。
（8）降落PCR在最開始的循環(huán)，退火溫度應(yīng)高于AP1引物的Tm值。
（9）當(dāng)循環(huán)結(jié)束時，用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，制備1.2%的TAE buffer瓊脂糖凝膠。
（10）利用膠回收試劑盒回收3-4 kb的RACE產(chǎn)物，長的片段使用電洗脫方法。
（11）第一輪擴(kuò)增為不對稱PCR，PCR擴(kuò)增時使用的兩種引物濃度不同,一般高濃度引物與低濃度引物的濃度比為50-100:1；在不對稱PCR中最初10-15個循環(huán)的產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，待低濃度引物耗盡后,繼續(xù)由高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生大量單鏈DNA。
（12）如果已知序列較短，先進(jìn)行3′ RACE，再進(jìn)行5′ RACE。
Q1: 模板中有特殊二級結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄提前終止？
A1: 提高反轉(zhuǎn)錄溫度、加大反應(yīng)體系，將反轉(zhuǎn)錄過程中易、已變性的RNA模板一直保持在50℃以上，避免已解開的二級結(jié)構(gòu)的RNA再恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增到5′?末端。
Q2: RNA質(zhì)量？
A2: 含有目的基因高表達(dá)的RNA或組織，在RNA提取的過程中避免降解，注意RNA的完整性。
Q3: RACE-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物無條帶或只有微弱條帶?
A3: 將PCR反應(yīng)管重新放進(jìn)PCR儀中，在68 ℃多加5個循環(huán)；若片段長度為2-5 kb，延伸時間4 min，0.2-2 kb，延伸時間為2-3 min，5-10 kb，延伸時間為10 min。
Q4: 有非特異性擴(kuò)增？
A4: 重新設(shè)計(jì)特異性引物。
優(yōu)點(diǎn)：克隆全長cDNA費(fèi)用廉價、實(shí)驗(yàn)周期短、操作步驟簡單。
局限性：5′?末端RACE在逆轉(zhuǎn)錄、TdT同聚物加尾、PCR擴(kuò)增這三個酶促反應(yīng)，每一步反應(yīng)失敗都會影響最終結(jié)果[6]；3個酶促反應(yīng)順利進(jìn)行，結(jié)果也經(jīng)常會出現(xiàn)一些非特異性產(chǎn)物和非全長的產(chǎn)物，因此需要不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案提高產(chǎn)物的特異性；克隆長片段或低豐度的基因時效率低[7]。
測序結(jié)果與已知序列重疊；數(shù)據(jù)庫同源序列的比對。
儀器：分光光度計(jì)；PCR儀；紫外照射儀；電泳儀；照膠儀；離心機(jī)等。
試劑：RNA提取試劑；反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑；RACE相關(guān)試劑盒等。
參考文獻(xiàn)
1. Frohman MAet? Rapid production of full-length cDNA race transcriptstranscripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1988, 85: 8998-9002.
2. Loh EY et al. Polymerase chain reaction with single-sided specificity:Analysis of T cell receptor delta chain [J]. Science, 1989, 243:217-220.
3. Ohara O et al. One-sided polymerase chain reaction: The amplification of cDNA [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86: 5673-5677.
4. 沈元月. RACE技術(shù)研究進(jìn)展與展望[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008,131-134.
5. 鄭陽霞等. RACE技術(shù)及其在植物基因研究中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36: 2674-2676.
6. Schaefer BC. Resolution in rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-lengh cDNA end [J]. Anal Biochem,1995, 227: 255-273.
7. 王少麗等. cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 遺傳, 2004, 26: 419-423.
8. 徐燁等. 幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2012, 14: 81-87.
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